海膽不同亞群遺傳性分析

光棘球海膽（Ｓｔｒｏｎｇｙｌｏｃｅｎｔｒｏｔｕｓ　ｎｕｄｕｓ）屬棘皮動物門、游在亞門、海膽綱、正形目、球海膽科［１］。在國內(nèi)某些文獻中有時也稱大連紫海膽，日文文獻中稱為北方紫海膽。光棘球海膽是西北太平洋沿岸海域較常見的經(jīng)濟類海膽之一，也是中國北方沿海重要的增養(yǎng)殖經(jīng)濟種類，主要分布于遼東半島、山東半島的黃海一側(cè)海域及渤海海峽的部分島礁周圍。光棘球海膽的殼徑可達１００ｍｍ以上，成熟季節(jié)生殖腺呈橙黃色，色澤鮮艷，品質(zhì)上佳，是中國北方重要的出口海珍品之一。自光棘球海膽人工育苗首次獲得成功后［２］，其人工養(yǎng)殖和育苗生產(chǎn)開始受到人們的關(guān)注［３－５］。目前，該種已成功在山東、遼寧沿岸開展規(guī)?；鲳B(yǎng)殖并取得了良好的經(jīng)濟效益。開展光棘球海膽不同地理亞群的遺傳多樣性研究，對保護并合理開發(fā)利用光棘球海膽的種質(zhì)資源，在優(yōu)良抗逆品種的選育過程中開展種質(zhì)鑒定和親本選擇，促進光棘球海膽?zhàn)B殖業(yè)的健康和持續(xù)發(fā)展都具有重要的意義。采用分子標(biāo)記對海膽遺傳多樣性分析的研究，國內(nèi)外已有相關(guān)的報道［６－１０］。ＡＦＬＰ技術(shù)具有多態(tài)位點檢測率高、重復(fù)性好、所需ＤＮＡ樣品較少、不需要提前預(yù)知任何遺傳信息、可以一次性得到大量標(biāo)記位點并呈孟德爾遺傳等優(yōu)點［１１］，能夠檢測親緣關(guān)系非常近的材料之間的差異，因而在水生動物方面廣泛用于遺傳多樣性分析、遺傳圖譜構(gòu)建等研究［１２－１３］。本試驗利用篩選的４對ＡＦＬＰ引物對日本青森縣、大連長?？h和大連旅順口區(qū)３個光棘球海膽的野生群體進行遺傳多樣性分析。

１　材料與方法

１．１　試驗材料

試驗 所 用 的 光 棘 球 海 膽 日 本 青 森 縣 群 體（ＱＳ），于２００８年４月取自日本青森縣，大連長海縣群體（ＣＨ），于２００８年１月取自大連長?？h，大連旅順群體（ＬＳ），于２００７年１０月取自大連旅順口區(qū)。用剪刀沿口器周圍剪開，取口器，用解剖刀刮取肌肉，７５％酒精保存于－２０℃冰箱備用。

１．２　基因組ＤＮＡ提取及檢測

日本青森縣群體和大連旅順群體各取５０個個體，大連長?？h群體取４３個個體，這些個體的基因組ＤＮＡ的提取參照《分子克隆實驗指南》［１４］，略作改動。采用１％的瓊脂糖凝膠電泳檢測所提取的ＤＮＡ，ＩＭＰＬＥＮ　Ｎａｎｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒ核酸蛋白檢測儀測定ＤＮＡ的 含 量 和 純 度，－２０ ℃保 存，用 于ＡＦＬＰ試驗。

１．３　ＡＦＬＰ分析

ＡＦＬＰ操作流程參照Ｖｏｓ等［１１］的程序并略加改動，以優(yōu)化試驗條件，確定ＡＦＬＰ的最佳反應(yīng)體系。ＡＦＬＰ操作流程中所使用的酶和引物等試劑藥品均購自上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司。取約２００ｎｇ基因組ＤＮＡ采用雙酶切，分別在３７℃用ＥｃｏＲ?。珊停叮怠嫦掠茫停螅濉。筛飨常?；然后與ＥｃｏＲ　Ｉ和Ｍｓｅ?。山宇^在１６℃下連接過夜６５℃；１０ｍｉｎ使連接酶失活后進行預(yù)擴增；預(yù)擴增用含有１個選擇性堿基的引物，并在１％的瓊脂糖凝膠電泳檢測，使其出現(xiàn)１００～１０００ｂｐ的Ｓｍｅａｒ帶；將預(yù)擴增產(chǎn)物稀釋２０倍后作為模板用含有３個選擇性堿基的引物進行選擴增（接頭及引物序列見表１）。擴增產(chǎn)物在４．５％的變性聚丙烯酰胺凝膠上進行６０Ｗ恒功率高壓電泳，電泳結(jié)果進行銀染檢測。標(biāo)記由引物組合及阿拉伯?dāng)?shù)字按分子量由大到小進行命名。選擇性擴增使用了８種ＥｃｏＲ　Ｉ引物和８種Ｍｓｅ?。梢锕玻叮磦€引物組合，通過預(yù)試驗，從這些組合中選取擴增帶數(shù)目適中、分布均勻和多態(tài)性高的４對引物組合，分別是Ｅ３８Ｍ６１（Ｅ００－ＡＣＴ，Ｍ００－ＣＴＧ）、Ｅ３９Ｍ５０（Ｅ００－ＡＧＡ，Ｍ００－ＣＡＴ）、Ｅ４４Ｍ５０（Ｅ００－ＡＴＣ，Ｍ００－ＣＡＴ）和Ｅ３２Ｍ４８（Ｅ００－ＡＡＣ，Ｍ００－ＣＡＣ）。

１．４　數(shù)據(jù)處理

銀染之后得到的帶譜，利用ＡＦＬＰ分析軟件Ｃｒｏｓｓ　Ｃｈｅｃｋｅｒ?。觯澹颍螅椋铮睢。玻梗郏保担葸M行分析。有帶記為１，無帶記為０，獲得０、１矩陣。統(tǒng)計計算群體內(nèi)的多態(tài) 位 點 比 例 （Ｐ ＝多 態(tài) 位 點 數(shù)／位 點 總 數(shù)×１００％），以及利用ＰｏｐＧｅｎ３２軟件計算Ｎｅｉ’ｓ基因多樣性［１６］、Ｓｈａｎｎｏｎ多樣性指數(shù)［１７］、群體間遺傳相似度及遺傳距離［１８］。根據(jù)個體間的遺傳距離矩陣，采用ＰＨＹＬＩＰ３．６９［１９］的ＮＥＩＧＨＢＯＲ程序以ＵＰ－ＧＭＡ的方法對所有個體聚類。

２　結(jié)果與分析

２．１?。硞€地理亞群的ＡＦＬＰ擴增結(jié)果

應(yīng)用４對引物組合從３個群體中共得到２３１個擴增位點，大小為５０～１０００ｂｐ（表２）。各引物組合得到的擴增位點分別為：Ｅ３８Ｍ６１得到６５個，Ｅ３９Ｍ５０得到６３個，Ｅ４４Ｍ５０得到６７個，Ｅ３２Ｍ４８得到３６個，多態(tài)位點總數(shù)１６８個，總的多態(tài)位點比例為７２．７３％，平均每個引物組合擴增出多態(tài)性位點數(shù)目為４２個，表明ＡＦＬＰ技術(shù)可以產(chǎn)生豐富的多態(tài)性條帶，同時，本研究所應(yīng)用的４對引物組合均可產(chǎn)生較多 的多態(tài)性 條 帶 （表２）。引 物 組 合Ｅ３２Ｍ４８對３個群體的擴增譜帶見圖１。

２．２?。硞€地理亞群的遺傳多樣性分析

３個群體內(nèi)的Ｎｅｉ’ｓ基因多樣性指數(shù)和Ｓｈａｎ－ｎｏｎ多樣性指數(shù)及相關(guān)遺傳參數(shù)見表３。從Ｎｅｉ’ｓ基因多樣性指數(shù)來看，大 連長海縣群體 最大，為０．３０２０±０．１９２５，其次為大連旅順群體０．２９９５±０．１９７７，日本青森縣群體的最小０．２９４５±０．１９３５；群體內(nèi)的Ｓｈａｎｎｏｎ多樣性指數(shù)與Ｎｅｉ’ｓ基因多樣性指數(shù)的變化趨勢相同，從大到小依次為大連長?？h群體０．４３９０±０．２７６７、大連旅順群體０．４３４４±０．２８２０、日本青森縣群體０．４２９８±０．２７６６。大連長?？h群體在多態(tài)位點比例、Ｎｅｉ’ｓ基因多樣性指數(shù)、Ｓｈａｎｎｏｎ多樣性指數(shù)等參數(shù)略高于其他兩個群體。群體內(nèi)總的遺傳變異值為０．３０５７±０．０３８４；群體內(nèi)的遺傳分化系數(shù)為０．２９８７±０．０３６６；群體間的遺傳分化系數(shù)為０．０２３０，明顯小于群體內(nèi)的遺傳分化系數(shù)，說明群體內(nèi)的遺傳多樣性比較豐富。

２．３　遺傳距離及聚類分析

光棘球海膽３個群體間的遺傳距離和遺傳相似度見表４（對角線以上是遺傳相似度，對角線以下是遺傳距離）。由表４可見，３個群體之間的遺傳距離沒 有 較 大 的 差 異，分 別 為０．０１０４、０．０１０７和０．０１０６；遺傳相似度也基本一致，分別為０．９８９７、０．９８９３和０．９８９４。這個結(jié)果與地理位置的遠近形成明顯的對比，說明３個群體間未因地理隔離而產(chǎn)生明顯的遺傳分化。根據(jù)４對引物的擴增結(jié)果和群體間遺傳距離矩陣，用ＰＨＹＬＩＰ?。常叮管浖裕眨校牵停练椒▽Γ硞€群體的１４３個個體進行聚類，聚類結(jié)果見圖２。由圖２可見，在最初的兩個分支中，下面的分支中ＣＨ群體的１５個個體聚在一起，ＬＳ群體的ＬＳ１４和ＱＳ群體的ＱＳ１１聚在一起，另外有ＬＳ群體的ＬＳ４４和ＬＳ４６，ＱＳ群體的ＱＳ７聚類在此分支中；而上面的分支中３個群體的個體混雜在一起，沒有明顯的聚類規(guī)律。通過分析上述結(jié)果表明：３個群體間沒有因為地理隔離而產(chǎn)生明顯的遺傳分化，３個群體間具有很高的遺傳相似度。因此，盡管３個群體內(nèi)的遺傳多樣性較為豐富，但群體間的地理分化特征并不明顯。
３　討論

本研究采用ＡＦＬＰ技術(shù)，通過４對引物對光棘球海膽的３個地理亞群進行了遺傳分析，共得到２３１個擴增位點，其中１６８個多態(tài)位點，總的多態(tài)位點比例為７２．７３％，表明ＡＦＬＰ技術(shù)可以產(chǎn)生豐富的多態(tài)性條帶；同時，本研究發(fā)現(xiàn)大連長?？h群體的遺傳多樣性最豐富，多態(tài)位點比例、Ｎｅｉ’ｓ基因多樣性指數(shù)、Ｓｈａｎｎｏｎ多樣性指數(shù)等參數(shù)都高于其他兩個群體，表明ＡＦＬＰ技術(shù)可以同時用于群體間遺傳差異的比較和群體內(nèi)個體的遺傳組成情況分析。群體內(nèi)的遺傳分化系數(shù)為０．２９８７±０．０３６６，而群體間的遺傳分化系數(shù)為０．０２３０，明顯小于群體內(nèi)的遺傳分化系數(shù)，說明群體內(nèi)的遺傳多樣性比較豐富。本研究的３個群體均為野生群體，并且光棘球海膽目前增殖放流史很短，規(guī)模不大，因而避免了近親交配等因素對群體遺傳多樣性的不利影響，遺傳結(jié)構(gòu)多樣性保存完好，蘊藏著比較豐富的育種潛力。

從遺傳距離和群體聚類分析上來看，３個群體之間的遺傳距離沒有較大的差異，３個群體的１４３個個體之間沒有形成明顯的聚類分支，而是混雜在一起，說明３個群體間沒有因為地理隔離而產(chǎn)生明顯的遺傳分化，３個群體間具有很高的遺傳相似度。因此，３個群體內(nèi)的遺傳多樣性較為豐富，群體間的地理分化特征并不明顯。造成這種結(jié)果的主要原因可能是３個地理亞群所處的地理環(huán)境比較相似，特別是在溫度和鹽度兩個對海膽的生長發(fā)育起關(guān)鍵作用的環(huán)境因子的差異不大，因而不同的地理位置對光棘球海膽的生長和發(fā)育所產(chǎn)生的影響不足以形成生殖隔離，因而３個地理亞群之間的地理分化特征并不明顯。