肥料對魚塘菌群數(shù)量結(jié)構(gòu)的影響：有機肥營養(yǎng)成分更豐富，肥效維持時間更長，細菌種群豐富度增加更明顯和持久

水產(chǎn)養(yǎng)殖實踐中，主要以施肥為濾食性魚類和魚苗培養(yǎng)浮游生物餌料［1 －2］。施肥養(yǎng)魚就是向水中投施有機肥( 糞、草等) 或化肥( 包括氮肥和磷肥)來補充和增加水中氮、磷等營養(yǎng)元素含量，以促進浮游生物的生長繁殖。池塘、水庫施肥會引起水體中氮磷含量、有機質(zhì)和浮游生物量相應(yīng)增加以及改變原有的水化學(xué)平衡，進而也可能影響水體微生物種群的改變。池塘、水庫中數(shù)量眾多、種類復(fù)雜的細菌種群可將水體中的有機質(zhì)分解轉(zhuǎn)化，以無機鹽的形式釋放到水體。同時，細菌作為原生動物直接或間接的餌料，是微型食物網(wǎng)中的重要一環(huán)，在水體生態(tài)系統(tǒng)中起著非常重要的作用［3 －5］。本研究采用 PCR － DGGE 技術(shù)對水體中分別施入有機肥和化肥后的細菌種群變化進行研究，探討水體中細菌種群發(fā)生的變化規(guī)律。

1 材料與方法

1. 1 試驗設(shè)計

試驗于 2010 年 7 月在西南大學(xué)科研漁場進行，試驗選擇 3 個池塘，每個池塘面積為 8 m × 17 m，水深 1. 2 m，每個池塘放入 100 g 左右的魚苗 15尾。施化肥池塘( N) 施入碳酸氫銨 0. 80 kg 和磷酸一銨 0. 25 kg，施有機肥池塘 ( M) 施入干雞糞15. 0 kg，不施肥池塘 ( C) 作對照。碳酸氫銨和磷酸一銨分別用水溶化后均勻潑灑入池塘，干雞糞用水浸泡 2 h 后均勻撒入池塘中。

1. 2 樣品采集與處理

1. 2. 1 采樣設(shè)計與測試指標(biāo)

每個池塘于施肥前( 0 d) ，施肥后第 2、4、6天采樣，采樣時間均為每天下午 4∶ 00，每個池塘采集 4 個點，每個點用采水器采集 2 L 水樣。每次采樣前池塘中水溫和溶氧用 SG6 溶氧儀測定，透明度( SD) 用薩氏盤測定，pH 值用酸度計測定; 氨氮( NH4+－ N) 、硝酸鹽氮( NO3－－ N) 、亞硝酸鹽氮( NO2－－ N) 和有效磷( PO43 －－ P) 測定按 《水和廢水監(jiān)測分析方法》［6］，細菌總數(shù)采用 DAPI 染色，熒光顯微鏡檢測方法進行測定［7］。

1. 2. 2 細菌 DNA 提取

水樣用直徑 150 mm，孔徑 0. 22 μm 的微孔濾膜過濾，濾膜上的細菌用 10 mmol/L 磷酸鹽緩沖溶液( 10 mmol/L 磷酸鹽，2. 7 mmol/L 氯化鉀和 137mmol / L 氯化鈉) 洗下，12000 r / min 離心 20 min，用 Soil Out DNA kit 試劑盒提取細菌總 DNA［8］。

1. 2. 3 PCR 擴增

提取的總 DNA 用引物: 357F － GCclamp( 5' －CGCCGGGGGCGCGCCCCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGG GGCCTACGGGAGGCAGCAG － 3') 和 518R( 5'－ ATTACCGCGGCTGCTGG － 3') 擴增 16S rDNA 的V3 區(qū)。 PCR 的總反應(yīng)體系為 25 μL: 10 × PCRbuffer ( 含 Mg2 +) 2. 5 μL，2. 5 mmol/L dNTPs 2. 0μL，引物( 20 μmol/L) 0. 5 μL，DNA 模板 1 μL，40 mg / mL 牛血清白蛋白 5 μL，5 U / μL 的 ExTaqDNA 聚合酶 0. 25 μL，去離子水加至 25 μL。采用梯度 PCR 擴增，PCR 反應(yīng)條件: 95 ℃ 預(yù)變性5 min，前 12 個循環(huán)為 95 ℃ 變性 30 s，退火溫度59 ～ 54 ℃ ， 每個循環(huán)降低 0. 5 ℃ ， 復(fù)性 35 s，72 ℃ 延伸 45 s; 后 19 個循環(huán)在恒定退火溫度下進行，95 ℃ 變性 30 s，54 ℃ 退火 30 s，72 ℃ 延伸45 s，最后在 72 ℃ 持續(xù)延伸 7 min，4 ℃ 保持。PCR 產(chǎn)物經(jīng) 1. 0% 瓊脂糖凝膠電泳檢測［9］。

1. 2. 4 DGGE 凝膠電泳

DGGE 分析變性劑范圍為 30% ～ 60% ( 100%變性劑為 7 mol/L 的尿素和 40%的去離子甲酰胺的混合物) ，10%的聚丙烯酰胺膠( 丙烯酰胺/雙丙烯酰胺 37. 5∶ 1) 。于 60 ℃，220 V 條件電泳 5 min，85 V 條件電泳 16 h，采用銀染法顯色［10］。用無菌手術(shù)刀片將 DGGE 膠上的每個 DNA 條帶分別切下，用 1 × PCR 緩沖溶液 40 μL 洗滌兩次，再用槍頭搗碎，用 1 × PCR 緩沖溶液 40 μL 浸泡，4 ℃ 過夜;取過夜浸泡液 5 μL 中含的 DNA 片段作模板用未加夾子的 16S rDNA 的 V3 區(qū)引物進行 PCR 擴增，PCR 擴增產(chǎn)物用 DNA 膠回收試劑盒純化［10］。

1. 2. 5 DGGE 條帶克隆、測序

取 1. 2. 4 的 PCR 擴增產(chǎn)物純化液 5 μL 加入10 μL的 PMD － 18T 載體體系中，16 ℃ 下進行過夜連接; 取 5 μL 的連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入大腸桿菌 GM109 感受態(tài)細胞中，涂 LB 平板，進行藍白斑篩選，挑取白斑，振蕩培養(yǎng)12 h。提取培養(yǎng)陽性菌的質(zhì)粒，用16S rDNA 的 V3 區(qū)引物按照 1. 2. 3 進行 PCR 擴增，取 5 μL 擴增產(chǎn)物作 DGGE 分析，將與 DGGE 分析膠上各個條帶處于同一位置的不同質(zhì)粒送上海英駿公司測序［11］。

1. 3 系統(tǒng)進化分析

將測序獲得的 DGGE 條帶序列與 NCBI 網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)庫 ( http: / /www. ncbi. nlm. nih. gov/blast/) 中的同源序列進行比對，根據(jù)比對結(jié)果，用 Clustal1. 83和 Mega4. 0 進行相似性分析及系統(tǒng)發(fā)育樹分析［8］。

1. 4 數(shù)據(jù)分析

用 Quantity One 4. 4. 0 軟件檢測 DGGE 電泳條帶光密度，根據(jù)條帶光密度值計算細菌種群的相對豐度［12］。根據(jù)每個樣品在 DGGE 圖譜上的條帶信息，計算細菌 Shannon － Weaver 多樣性指數(shù)( H) 、豐富度( S) 和均勻度( EH) : H = － Σpilnpi，EH=H / lnS，式中，Pi為第 i 條帶光密度值占該樣品總條帶光密度值的比值，S 為某一泳道總條帶數(shù); 用SPSS13. 0 軟件進行細菌種群相似性聚類分析［13］。

2 結(jié)果與分析

2. 1 施肥對水體理化指標(biāo)和細菌數(shù)量的影響

不同時間水體的理化環(huán)境參數(shù)和細菌數(shù)量見表1。3 個池塘施肥前的溫度、pH、溶氧、NH+4－ N、NO－3－ N、NO－2－ N 、PO3 －4－ P、透明度和細菌數(shù)量等相似，在試驗期，3 個池塘水溫在 31 ～ 33 ℃之間，變化不大，且對照池塘的這些環(huán)境理化參數(shù)在施肥前、2、4 和 6 天變化均較小，施肥池塘的環(huán)境理化參數(shù)變化較大。與對照組比較，pH 值在施化肥后升高，第 2 天達最高，之后逐漸下降，施有機肥后 pH 值則低于對照; 施化肥后池塘溶氧急劇增加，在第 4 天達到最高，而施有機肥后池塘溶氧反而下降。施化肥或有機肥后NH+4－ N和 PO3 －4－ P 濃度均增加，之后逐漸下降但仍高于對照，其中施化肥的池塘其濃度增加非常明顯，在第 2 天達到最高。池塘施無機或有機肥后NO－3－ N和 NO－2－N 濃度均增加，施有機肥的池塘增加更明顯，之后均逐漸下降。池塘施肥后水體透明度較對照組均下降，而施化肥的池塘水體透明度最低。

2. 2 施肥對細菌種群及多樣性指數(shù)的影響

施肥與對照池塘不同時間細菌種群 PCR －DGGE 圖譜如圖 1 ( A) ，對各細菌種群的聚類分析如圖1( B) ，細菌種群多樣性指數(shù)見表2。在 DGGE圖譜中，對照、化肥和有機肥池塘在未施肥時DGGE 條帶數(shù)分別為 16、16 和 14 ( 表 2) ，對照和施化肥池塘的 DGGE 條帶數(shù)及遷移率完全相同，而施有機肥池塘則顯示一定差異，聚類分析也說明3 個池塘的細菌種群相似性非常高，而且細菌種群多樣指數(shù)、均勻度和豐富度也相近。施肥后第 2 天3 個池塘 DGGE 條帶數(shù)分別為 16、20 和 20，施肥池塘的細菌種群豐富度明顯增加，特別是施有機肥的池塘增加更明顯，與對照池塘顯示出明顯的差異，細菌多樣性指數(shù)明顯高于對照; 聚類分析顯示3 個池塘之間的細菌種群相似性低于施肥前 3 個池塘的相似性。施肥后第 4 天3 個池塘 DGGE 條帶數(shù)分別為 15、20 和 18，不同處理池塘細菌種群發(fā)生明顯變化，聚類分析也顯示不同池塘之間的細菌種群相似性極低，施化肥池塘群落結(jié)構(gòu)單獨聚為一族，細菌多樣性指數(shù)高于對照，但以施有機肥細菌多樣性指數(shù)最高。3 個池塘在施肥后第 6 天 DGGE條帶數(shù)分別為 15、15 和 20，聚類分析顯示施有機肥的池塘細菌種群與其第 4 天的種群結(jié)構(gòu)具有較高的相似度，說明其細菌種群逐漸趨于穩(wěn)定，而施有機肥的池塘水體細菌種群與其它池塘比較仍具有大的差異性和種群豐富度; 施化肥池塘的細菌種群與其它池塘的群落結(jié)構(gòu)相似性增加，而細菌多樣性指數(shù)下降，說明其細菌種群在逐漸恢復(fù)為施肥前的種群結(jié)構(gòu)。而對照池塘的細菌種群在第 2、4 和 6 天時與施肥前具有較高的相似性，表明對照池塘中的細菌種群變化較小。

2. 3 DGGE 條帶的系統(tǒng)發(fā)育學(xué)分析

DGGE 膠上通過割膠回收再次 PCR 擴增此片段，測序，共有 38 個條帶能得到擴增產(chǎn)物，在NCBI BLAST 對得到的 38 個條帶序列相似性分析，條帶 33 與數(shù)據(jù)庫中 HQ661264. 1 序列具有較低相似性( 91%) ，其余條帶與數(shù)據(jù)庫中的相應(yīng)序列有較高的相似性，均在 95% ～100%。38 個條帶獲取的相似序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹如圖 2。這些序列分布于 5 個已知的門。有 7 個條帶代表的細菌種群組成厚壁菌門，5 個條帶組成放線菌門，3 個條帶組成藍細菌門，而條帶 24 代表擬桿菌門，其余 22 個條帶構(gòu)成變形桿菌門。變形桿菌門中，β － 變形桿菌綱 12 條，為最優(yōu)勢類群，γ－ 變形桿菌綱種群有 5 個條帶，α － 變形桿菌綱有3 個條帶，條帶 4 和 5 組成 δ － 變形桿菌綱種群。

2. 4 施肥對細菌種群及其相對豐度的影響

施肥和對照池塘細菌種群組成相對豐度見圖3。放線菌門、厚壁菌門和 α 和 β － 變形桿菌綱等種群出現(xiàn)在所有池塘中。池塘在施化肥后第 2 天新檢測到擬桿菌門、藍細菌門和 γ － 變形桿菌綱等種群; 第 4 天未檢測到擬桿菌門種群，但藍細菌門、β － 和 γ － 變形桿菌綱等種群的相對豐度增加，厚壁菌門和放線菌門等種群的相對豐度明顯下降; 第6 天未檢測到 δ － 變形桿菌綱等種群，而檢測到擬桿菌門種群，厚壁菌門種群的相對豐度比第 4 天增加，藍細菌種群的相對豐度下降。施有機肥池塘在第 2 天新檢測到擬桿菌門種群，γ － 變形桿菌綱種群的相對豐度增加，而 β － 變形桿菌綱種群的相對豐度略下降; 第 4 天新檢測到藍細菌門種群，γ －變形桿菌綱等種群的相對豐度更低，而厚壁菌門種群的相對豐度增加; 第 6 天未檢測到 γ － 和 δ － 變形桿菌綱等細菌種群，厚壁菌門種群的相對豐度增加到最高。施肥對 α － 變形桿菌綱種群影響極小，以及對照池塘細菌種群和相對豐度變化不大。

3 討論

施入水體的化肥為易溶于水的碳酸氫銨，同時銨態(tài)氮( NH4+－ N) 可以轉(zhuǎn)化為硝態(tài)氨 ( NO3－－N) ，而亞硝態(tài)氮( NO2－－ N) 是轉(zhuǎn)化的中間形式。磷酸鹽( PO43 －－ P) 為易溶的磷酸一銨，因此，施肥后 NH4+－ N、NO3－－ N、NO2－－ N 和 PO43 －－P 都是在第 2 天含量達到高峰，之后被浮游藻類吸收利用而逐漸下降，這與朱愛民等［14］的報道一致。化肥能促進浮游藻類生長，而藻類通過光合作用釋放大量氧氣，水體溶氧增加，豐富的浮游生物也降低了水體透明度。而有機肥中有機質(zhì)發(fā)酵釋放出來的 N、P 含量有限，NH4+－ N、NO3－－ N、NO2－－ N 和 PO43 －－ P 含量增加幅度沒有化肥明顯，浮游藻類增加不如化肥，而且有機肥會培育大量的浮游動物攝食浮游藻類，同時有機質(zhì)發(fā)酵還會消耗水體中的溶氧導(dǎo)致水體溶氧比對照組更低。施有機肥的池塘由于富含有機質(zhì)，適合細菌、真菌等微生物快速繁殖生長，因此，施有機肥的水體細菌總數(shù)明顯高于施化肥和對照組，水體的透明度低于對照組。有機肥發(fā)酵產(chǎn)生部分有機酸導(dǎo)致 pH 值下降，這與周本翔［2］的研究報道基本一致。PCR － DGGE 是一種快速、可靠的檢測微生物群落結(jié)構(gòu)組成的分子生物學(xué)方 法［4，8，15］，根 據(jù)DGGE 原理，每一個 DGGE 條帶代表一種微生物種群或一個可操作單元［16］。本研究利用該技術(shù)在不同樣品中均檢測到豐富的 DGGE 條帶數(shù)，說明池塘中存在豐富的細菌種群，不同處理池塘中均存在厚壁菌門、放線菌門以及變形桿菌門中的α － 、β－ 變形桿菌等優(yōu)勢種群，與 Glockner 等［17］、鄭小紅等［18］等報道水體、湖泊的優(yōu)勢種群組成相似。王曉丹等［19］報道密云水庫細菌種群隨著季節(jié)發(fā)生變動，表明池塘或水庫中的細菌種群會隨著環(huán)境變化而改變。本研究表明施肥對池塘中細菌種群有明顯的影響，施肥能提高 N、P 含量，同時藍細菌在施化肥后第 2 天、施有機肥后第 4 天成為優(yōu)勢種群，氮、磷含量高的富營養(yǎng)水體易導(dǎo)致藍細菌暴發(fā)［20 －21］。在施肥后的池塘中均檢測到擬桿菌門細菌種群，說明施肥能促進擬桿菌門細菌種群的生長，因為擬桿菌是糞便污染的主要標(biāo)志之一［22］，擬桿菌門種群也是富營養(yǎng)化水體中的優(yōu)勢種群［18］。厚壁菌門種群是廣泛存在于水體中的一類細菌類群，鄭小紅等［18］研究發(fā)現(xiàn)厚壁菌門種群是玄武湖微囊藻水華時期水體內(nèi)主要優(yōu)勢群之一。本研究表明有機肥能促進厚壁菌門種群的生長，到第 6 天達到最高，厚壁菌門中以芽孢桿菌屬、產(chǎn)乳酸桿菌屬、梭菌屬等菌群為主，與解開治等［23］研究發(fā)現(xiàn)豬糞在腐熟發(fā)酵過程中優(yōu)勢菌群為梭菌屬、芽胞桿菌屬等相一致; 施化肥后厚壁菌門種群的相對豐度先逐漸降低，到第 4 天最低，而第 6 天又逐漸升高，說明化肥會抑制厚壁菌門種群的生長。施化肥后第 4 天和 6 天 β － 和 γ － 變形桿菌綱種群的相對豐度明顯高于其它處理池塘，而放線菌門種群的相對豐度最低，這可能與化肥中高含量的 NH4+－ N有利于 β － 和 γ － 變形桿菌綱中的亞硝化細菌和硝化細菌類群的生長，卻抑制放線菌門細菌種群的生長，說明放線菌門種群受化肥影響，α － 變形桿菌綱出現(xiàn)在所有池塘中，且其種群相對豐度變化不大，說明不受施肥影響。對照池塘雖未施肥，但池塘中本身存在的有機淤泥、水生動植物和微生物等每天也存在一定程度變化，進而會影響到其中的細菌種群，但變動幅度沒有施肥池塘明顯。劉桂婷等［4］研究發(fā)現(xiàn)施肥對細菌多樣性及群落結(jié)構(gòu)有影響，本研究說明施肥能增加細菌種群結(jié)構(gòu)多樣性指數(shù)，施化肥后第 2 天多樣性指數(shù)最高，施有機肥多樣性指數(shù)在第 4 天最高，之后均逐漸下降，分析可能是化肥速效能快速促進浮游藻類和部分微生物生長，而后隨著 N、P 營養(yǎng)成分含量下降，細菌種群多樣性指數(shù)降低; 而施有機肥后，大量富營養(yǎng)微生物快速生長，群落多樣性增加，隨著時間延長，部分細菌種群逐漸成為優(yōu)勢種群，細菌群落多樣性又逐漸降低并趨于穩(wěn)定，接近最初的原始狀態(tài)。施肥能明顯增加細菌種群豐富度，肥料中含有的營養(yǎng)成分有利于水體中部分細菌種群生長成為優(yōu)勢種群，增加水體中的細菌種群，有機肥營養(yǎng)成分更豐富，肥效維持時間更長，細菌種群豐富度增加更明顯和持久。