魚類精子的生物學(xué)---環(huán)境因子對(duì)魚類精子活力影響的機(jī)理

（三）環(huán)境因子對(duì)魚類精子活力影響的機(jī)理

精子的運(yùn)動(dòng)靠鞭毛的擺動(dòng)，其能量來(lái)自ATP水解所釋放的能量。關(guān)于水環(huán)境中各種因子對(duì)鞭毛擺動(dòng)的作用途徑，目前有下列假說(shuō)：

一是Ca2＋說(shuō)，認(rèn)為K＋/H＋的離子濃度比使Ca2＋進(jìn)人精子內(nèi)，激活腺苷酸環(huán)化酶，使ATP轉(zhuǎn)化成cAMP，進(jìn)而激活蛋白激酶，使15 KD蛋白質(zhì)被磷酸化，引起精子運(yùn)動(dòng)。

二是電動(dòng)勢(shì)說(shuō)，認(rèn)為海水魚精子的膜電動(dòng)勢(shì)通常是固定值。當(dāng)外界環(huán)境中離子或pH值發(fā)生變化時(shí)會(huì)引發(fā)膜電動(dòng)勢(shì)的變低。當(dāng)這一變化達(dá)到一定值時(shí)，就會(huì)使精子運(yùn)動(dòng)。

Ca2＋說(shuō)能解釋某些實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象，但缺乏普遍性；電動(dòng)勢(shì)說(shuō)對(duì)各種離子之間相互影響可以得出統(tǒng)一解釋，但許多實(shí)驗(yàn)表明，精子運(yùn)動(dòng)時(shí)伴有體內(nèi)Ca2＋濃度的瞬間升高。綜合上述兩種假說(shuō)，提出了第三種分子機(jī)制說(shuō)，認(rèn)為精子膜中分布著鈉泵、鉀泵、鈣泵等ATP水解酶。當(dāng)外界環(huán)境中的精子濃度發(fā)生變化時(shí)，精子通過(guò)這些離子泵來(lái)維系細(xì)胞內(nèi)的離子平衡和電荷平衡。當(dāng)各種離子濃度的變化超過(guò)一定限度時(shí)，精子通過(guò)改變細(xì)胞質(zhì)中Ca2＋的濃度來(lái)維持上述平衡。細(xì)胞質(zhì)中的Ca2＋濃度可以通過(guò)線粒體調(diào)節(jié)。Ca2＋進(jìn)人線粒體以后與磷酸根離子和（或）特異的蛋白質(zhì)結(jié)合。磷酸根的濃度降低，誘導(dǎo)AMP降解；蛋白質(zhì)本身是AMP環(huán)化酶的拮抗物。這種蛋白質(zhì)濃度降低時(shí)ADP轉(zhuǎn)化成cAMP，而ADP濃度的降低又促使ATP降解。ATP降解時(shí)產(chǎn)生大量能量，供精子運(yùn)動(dòng)之需。

（四）精液的保存

了解了魚類精子的生物學(xué)特點(diǎn)，不僅能科學(xué)地進(jìn)行人工授精，準(zhǔn)確地分析授精的效果，還能利用精子在低溫和原液條件下代謝水平低、壽命長(zhǎng)的特點(diǎn)，長(zhǎng)期保存精液。利用保存精液和卵子技術(shù)可以貯藏具有優(yōu)良性狀的遺傳物質(zhì)，解決親本不足或性成熟不同步及育種等問(wèn)題。魚類精液的保存包括低溫保存和超低溫保存兩種：前者指將精液保存在10℃～15℃（一般為0℃左右）的溫度中，后者指保存在-196℃的液氮生物容器中，受精前需解凍。

魚類精液保存技術(shù)的要點(diǎn)有以下幾方面：

1、親魚的選擇

經(jīng)魚類種質(zhì)的鑒定，符合種質(zhì)鑒定標(biāo)準(zhǔn)，達(dá)到性成熟年齡、體質(zhì)健康的雄親魚方能用做采精的親魚。

2、采精

先把魚體表的水擦干凈，用干燥潔凈的玻璃注射器或輕輕用手將精液吸入或擠入經(jīng)消毒干燥的試管或小瓶中，避免陽(yáng)光照射，最初幾滴精液擠掉不要。擠完后將容器加塞封好，放人暖水瓶中，加上半瓶冰塊。塞緊即可（最好逐漸加冰，使溫度緩慢下降）。用這種方法，在0℃~2℃時(shí)可使鯉精子存活 144～241 h；2℃~6℃時(shí)可使鰱精子存活264 h。

3、精液質(zhì)量檢查

用解剖針挑取少許鮮精液置于載玻片上，滴加自來(lái)水或池水后立即在顯微鏡或倒置顯微鏡下觀察和記錄精子的活力和運(yùn)動(dòng)時(shí)間。精子的活力標(biāo)準(zhǔn)分為五級(jí)：激烈運(yùn)動(dòng)（渦動(dòng)）、快速運(yùn)動(dòng)、慢速運(yùn)動(dòng)、搖擺運(yùn)動(dòng)、死亡。鯉科魚類選乳白色、精子比容在55%～65%之間、密度達(dá)250~400億精子/毫升、激活率達(dá)85%以上的鮮精液用做保存。

4、精子延壽劑

延壽劑指在精液保存過(guò)程中有利于延長(zhǎng)精子壽命的物質(zhì)，包括精液稀釋劑、抗生素、氧氣、抗凍劑等。精液中加入稀釋劑后，可延長(zhǎng)保存時(shí)間，便于受精操作，控制保存效果。為了得到良好的保存效果，精液中需加稀釋劑和防凍劑。稀釋劑又稱擴(kuò)展劑。不同魚類精液的最適稀釋劑有所不同，但它們均以魚類生理鹽水為基礎(chǔ)，模擬精液的組成成分，添加各種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和穩(wěn)定劑。稀釋液的pH值應(yīng)與魚類精液的pH值接近，一般在6.5～7.5之間；滲透壓在300毫滲左右。

配制稀釋劑的原則是：①稀釋劑的成分應(yīng)對(duì)精子無(wú)毒、無(wú)害、無(wú)副作用。②能抑制精子運(yùn)動(dòng)，使其保持原來(lái)的靜止?fàn)顟B(tài)。精子的運(yùn)動(dòng)既與外界水環(huán)境的滲透壓及離子，尤其是鉀離子的濃度有關(guān)，也與魚類種類有關(guān)。對(duì)大多數(shù)淡水魚來(lái)說(shuō)，低滲透壓是激發(fā)精子運(yùn)動(dòng)的主要因素，因此，配制淡水魚精液稀釋劑時(shí)，其滲透壓應(yīng)等于或高于精漿滲透壓。海水魚則相反，其稀釋劑的滲透壓應(yīng)等于或稍低于精漿滲透壓。魚類精漿的滲透壓一般為250-300 mosm/kg。③精子在低溫下仍有少許運(yùn)動(dòng)，稀釋劑中應(yīng)含一定的營(yíng)養(yǎng)物，如葡萄糖、卵黃、蜂蜜、牛奶等。④應(yīng)具有一定的緩沖能力，使稀釋的精液具有較穩(wěn)定的pH值。表4-5列出了一些養(yǎng)殖魚類精液稀釋劑的配方。不同魚類精液與稀釋劑適宜比值為：鯉科魚類1：1～1：4；鮭科魚類1：4～1：9。稀釋劑與精液混合時(shí)必須等溫。

為避免微生物污染，精液保存中必須添加抗生素。常用的抗生素及其劑量為：青霉素5000 IU/ml精液；硫酸新霉素l mg/ml精液；青霉素1000 IU/ml十鏈霉素5000 IU/ml精液；金霉素0.6 mg/ml精液。

主要養(yǎng)殖魚類精液稀釋劑配方（g/L）

魚類人工繁殖

精子在低溫狀態(tài)下仍要代謝耗氧。若將精液裝入密閉容器中，不接觸空氣，只能保存很短時(shí)間；若把裝精液的容器敞開，雖可延長(zhǎng)保存時(shí)間，但精液會(huì)蒸發(fā)干燥，并招致微生物污染，因而應(yīng)向密閉容器中通入濕潤(rùn)氧氣。這樣既為精液提供了氧氣，又可密閉容器，避免蒸發(fā)和污染。充入的氧氣可先通過(guò)蒸餾水再進(jìn)入容器，以免精液干燥。保存精液的容器要足夠大，留有一定空間。封閉瓶中精子和空氣之比為1：10～l：20較宜。

5、抗凍劑

一般認(rèn)為，在0℃以上保存精液不需加抗凍劑，但只能保存幾天，最多十幾天。在0℃以下或超低溫（-196℃）下，精液雖可長(zhǎng)期保存，但冷凍和解凍過(guò)程中的一系列理化變化，會(huì)對(duì)精子造成損傷。因此，長(zhǎng)期保存精液就必須添加防凍劑。精液的成分大部分是水，精液超低溫保存的關(guān)鍵主要取決于水的性質(zhì)。溫度低于精液冰點(diǎn)時(shí)水開始結(jié)冰，冰點(diǎn)至-60℃是形成有序狀態(tài)冰晶的溫度區(qū)。細(xì)胞內(nèi)冰晶的形成會(huì)機(jī)械損傷細(xì)胞結(jié)構(gòu)；細(xì)胞外結(jié)冰會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞失水，使細(xì)胞變形、破裂死亡。當(dāng)溫度低于-60℃時(shí)，有序狀態(tài)的冰晶減少；當(dāng)溫度低于-130℃時(shí)，水分子停止運(yùn)動(dòng)，保持原來(lái)的無(wú)序狀態(tài)，形成堅(jiān)硬、均質(zhì)的四塊結(jié)構(gòu)，這種現(xiàn)象叫玻璃化。玻璃化狀態(tài)的精子不會(huì)出現(xiàn)原生質(zhì)嚴(yán)重脫水的現(xiàn)象而使細(xì)胞保持完整結(jié)構(gòu)，精子解凍后即可恢復(fù)運(yùn)動(dòng)能力。因此，精液超低溫保存就是通過(guò)添加適當(dāng)?shù)谋Ｗo(hù)劑和增加冷凍速度。使精子安全越過(guò)冰晶形成區(qū)，進(jìn)入玻璃化狀態(tài)，避免嚴(yán)重脫水和低溫?fù)p傷，以便長(zhǎng)期保存。由于這種玻璃化狀態(tài)不穩(wěn)定，溫度回升至-60℃以上時(shí)，會(huì)發(fā)生次級(jí)結(jié)晶，因此，冷凍精液需置于液氮中長(zhǎng)期保存。

常用的魚類精液抗凍劑有二甲亞砜（DMSO）、乙二醇或甘油等，另外卵黃、蜂蜜、葡萄糖和牛奶等也有一定的抗凍作用。鯉、鰱、團(tuán)頭魴和草魚的精液經(jīng) 8%DMSO處理后，滲透壓增加至 1369 m Osm/L，谷草轉(zhuǎn)氨酶活性顯著增高，其精液冰點(diǎn)下降至-3.9℃。以 1%NaCI和0.05%KCI為基礎(chǔ)溶液，添加不同濃度的抗凍劑，結(jié)果表明，10%甘油加10%DMSO冷凍保存黑鯛、花鱸和大彈涂魚精液的效果最好。

抗凍劑可一次加入或分次加入，邊加邊輕輕搖動(dòng)，混合均勻，加入速度要慢，特別是甘油，以 2～3滴/min為宜。在常溫下應(yīng)盡量減少抗凍劑與精子的接觸時(shí)間。先將稀釋劑與DMSO按比例混合后，放入O℃～4℃冰箱中預(yù)冷，再將精液與預(yù)冷的抗凍稀釋劑按1：2～1：3的比例稀釋，再在0℃～4℃冰箱中平衡10～30 min液氮低溫（-196℃）保存精液，要先初凍（-90℃~～110℃）。液氮保存精液常用下列兩種方法：

小球法：將已加入了稀釋劑和防護(hù)劑的精液滴于液氮蒸氣上或二氧化碳干冰上，做成小球，約一分鐘后將小球放入 0.5 ml～lml的小安瓿瓶或塑料瓶中，放于液氮中保存。也可將銅沙網(wǎng)或銅板、鋁板置于液氮面上，再將精液稀釋劑滴于其上成滴凍顆粒，然后收起裝瓶，放入液氮中保存。

小瓶法：將已稀釋的精液置于5 C冰瓶?jī)?nèi)平衡30～50 min，然后裝入小瓶，每個(gè)鏈霉素小瓶裝 4ml。將小瓶置于液氮蒸氣上初凍，小瓶距液氮面1cm～2 cm，15 min后放入液氮中保存。

（1）貯存

容器內(nèi)的液氮必須浸沒(méi)凍精。應(yīng)經(jīng)常檢查容器內(nèi)液氮量和液氮容器的狀況，如發(fā)現(xiàn)異常，應(yīng)立即將凍精轉(zhuǎn)移到其他完好的容器內(nèi)。貯存的精液應(yīng)做好記錄。

（2）凍精解凍

將凍精顆粒包裝提至液氮蒸氣中平衡5 min，然后迅速取出凍精顆粒，放入25℃～30℃的解凍液中。如采用小瓶法保存，解凍時(shí)將器皿提至液氮罐口下平衡 5 min，然后迅速將安瓿瓶取出，放入30℃～40℃的溫水浴中，輕輕搖動(dòng)，使溫度均勻，待只剩一點(diǎn)凍屑時(shí)立即取出。在室溫（25℃）或溫水（39℃）中轉(zhuǎn)動(dòng)小瓶，融解冰凍保存的精液。

（3）受精

融解后的精液應(yīng)立即與卵子混合受精。受精前可用O.8%～1.5%的氯化鈉溶液激活保存的精液中的精子，在顯微鏡下檢查精子的活力。凍精受精率的高低，一方面取決于解凍后精子的活力，即活力強(qiáng)，受精率高。這已為許多實(shí)驗(yàn)證實(shí)。另一方面，也與精子的數(shù)量有關(guān)。在精子成活率相似的條件下，適當(dāng)增加凍精量，也會(huì)提高受精率。因此，確定適宜的精子和卵子數(shù)量比，以便既不浪費(fèi)凍精，又能獲得較高的受精率，這是個(gè)重要問(wèn)題。研究表明，人工受精時(shí)精卵的數(shù)量比以3萬(wàn)～4萬(wàn)/卵為宜，即每ml家魚精液可以使50萬(wàn)～100萬(wàn)粒卵受精。海水魚類這方面的研究尚需加強(qiáng)。