論文：鎘暴露對鰱幼魚游泳行為影響的研究

鎘暴露對鰱幼魚游泳行為影響的研究

黃應平1,2，Prashant Mandal1,2，靖錦杰1,2，蔣 清1,2，袁 喜1,2,3，涂志英1,2，胥 燾1,2

(1.三峽庫區(qū)生態(tài)環(huán)境教育部工程研究中心(三峽大學)，湖北宜昌 443002； 2.三峽地區(qū)地質(zhì)災害與生態(tài)環(huán)境湖北省協(xié)同創(chuàng)新中心(三峽大學)，湖北宜昌 443002； 3.中國科學院水生生物研究所，武漢 430072)

為了探討水體鎘(Cd)污染對魚類的生態(tài)毒理效應，在實驗室條件下，測定了不同濃度Cd(0、0.36、0.73、1.09和1.46 mg/L)暴露對鰱(Hypophthalmichthysmolitrix)幼魚半致死濃度、組織(肝、鰓、肌肉)Cd累積量、相對臨界游泳速度(Ucrit)、以及耗氧率(MO2)的影響。結(jié)果顯示：Cd暴露導致重金屬在幼魚組織中累積，與對照組比較，Cd在鰓和肌肉中累積量差異不顯著；肝臟中累積量差異顯著，暴露濃度為0.73 mg/L時肝臟中鎘累積量最高。鰱幼魚相對臨界游泳速度隨著Cd暴露增加顯著降低，濃度為1.46 mg/L時Ucrit為對照組的69.75%。臨界游泳速度與鰓和肌肉組織中鎘累積量呈顯著負相關(guān)，相關(guān)系數(shù)分別為-0.96 (P=0.01)和-0.90 (P=0.04)。Cd暴露導致鰱幼魚耗氧代謝范圍增加，暴露濃度為0.73 mg/L時耗氧代謝范圍較對照組增加了19.32%。低濃度Cd暴露導致鰓和肌肉損傷，并引起鰱幼魚游泳過程中耗氧代謝效率降低，有氧運動能力和游泳能力下降。

鎘；鰱(Hypophthalmichthysmolitrix)；臨界游泳速度；耗氧代謝范圍

重金屬是一類典型的環(huán)境污染物，通過暴露或食物鏈等途徑直接或間接地影響魚類的生理生態(tài)行為。魚類生物(行為)效應對重金屬的響應，在一定程度上反映水生生態(tài)系統(tǒng)受重金屬污染程度[1]。鎘是水體常見的重金屬污染物，通過生物富集和生物放大效應對水生生態(tài)系統(tǒng)產(chǎn)生重要影響，對水生無脊椎動物、兩棲動物和魚類等水生生物均具有較強的毒性[2-3]。鎘暴露對魚的鰓、肌肉、肝臟、腎、脾、大腦和神經(jīng)系統(tǒng)[4-8]等產(chǎn)生損傷，引起病理行為甚至導致死亡。高濃度鎘暴露導致鯉(Cyprinuscarpio)外周血紅細胞微核率和核異常率上升，機體損傷性和遺傳毒性增強[9]。三峽庫區(qū)蓄水前重慶江段主要經(jīng)濟魚類肌肉中鎘含量為0.031～0.24 mg/kg；內(nèi)臟中為0.18～0.75 mg/kg[10]，蓄水之后水體總鎘含量略有增加[11]，庫區(qū)魚類的生態(tài)風險增加，應引起重視。

游泳行為是魚類逃逸、捕食和繁殖等行為實現(xiàn)的主要方式[12]。臨界游泳速度(critical swimming speed,Ucrit)是最大的穩(wěn)定游泳速度，通常作為評價魚類游泳能力的重要指標[13]。臨界游泳速度誘導產(chǎn)生的有氧代謝能力可以用最大耗氧率表示，而有氧代謝范圍(aerobic metabolic range,MR)反映了魚類除滿足基本生理需求外完成其他有氧生理活動的潛在能力[14]，環(huán)境的變化能夠影響魚類的這種有氧生理活動的潛在能力[15]。鎘對魚類行為和代謝方面的研究國內(nèi)外已有報道，慢性亞致死劑量的鎘暴露導致鱒(Salmotrutta)和白鮭(Coregonusclupeaformis)重復游泳能力受損，疲勞后耗氧恢復較慢[16]。鎘暴露導致黃金鱸(Percaflavescens)肌肉中的二磷酸核苷激酶活性降低，相對耗氧代謝范圍顯著的降低，而且鎘主要影響其鰓的呼吸能力[17]。關(guān)于鎘暴露對鰱(Hypophthalmichthysmolitrix)幼魚游泳行為及耗氧率影響的研究未見報道。

本研究通過測定鰱幼魚鎘暴露半致死濃度，不同鎘濃度暴露鰱幼魚組織(肝、鰓、肌肉)鎘含量，相對臨界游泳速度(Ucrit)和耗氧率(MO2)，用于研究鎘暴露對鰱幼魚生態(tài)毒理效應、游泳能力和耗氧代謝的影響?？疾祧栍佐~運動和代謝等方面行為對水體鎘濃度變化響應靈敏性，用于評價鎘污染對鰱幼魚潛在的生態(tài)毒性，擴充水生生物毒性試驗材料，為自然水域受鎘污染研究提供基礎數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

實驗用鰱幼魚購自宜昌養(yǎng)殖場。實驗前將魚在魚缸(420 L)中馴化2周。每兩天投喂飼料1次(蛋白質(zhì)>38%，脂肪>5%，纖維素<5%，灰分<12%，濕度<11%)。馴養(yǎng)用水為曝氣后的自來水，馴養(yǎng)期間曝氣使水體溶氧水平接近飽和，日換水量約為水體的1/3，自然水溫20±1℃，自然光照。

馴養(yǎng)結(jié)束后，選取健康幼魚60尾，隨機平均分配至各濃度梯度組，實驗魚體長、體重參數(shù)如表1。根據(jù)急性毒性試驗結(jié)果，本研究共設5個鎘(Cd2+)濃度梯度，分別為0(0組)、0.36(1組)、0.73(2組)、1.09(3組)、1.46 mg/L(4組)，暴露時間為96 h。暴露期間不投餌，每日定時換水并補充相應濃度的硝酸鎘溶液以保持水體鎘濃度基本恒定，日換水量為水體的1/2。

表1 鰱幼魚的體長、體重參數(shù)(平均值±標準誤)

1.2 實驗方法

臨界游泳速度(Ucrit)的測定設備為魚類游泳能力測定裝置，該裝置的結(jié)構(gòu)和使用方法詳見文獻[18]。將在不同梯度的Cd2+暴露96 h后實驗魚轉(zhuǎn)入魚類游泳能力測定裝置中馴化2 h (流速為10 cm/s)。適應結(jié)束后，采用流速遞增法測定Ucrit，每間隔20 min，調(diào)節(jié)流速增加1 BL/s(體長/s)，直至實驗魚游泳疲勞(疲勞的判定標準為：實驗魚被水流沖到游泳區(qū)后面篩網(wǎng)上不能游泳，停留20 s，則視其疲勞[19])。臨界游泳速度采用公式：Ucrit=U1+(T1/T2)U2計算。式中，Ucrit為臨界游泳速度(BL/s)，U1為實驗魚所能完成游泳的最大速度(實驗魚疲勞前的速度，BL/s)，速度增量U2=1 BL/s)，T1為在最大速度下未能完成設定歷時的實際持續(xù)時間(T1<20 min)，時間間隔T2=20 min。

實驗過程中每間隔10 min中測定一次水中溶解氧量。利用水泵進行內(nèi)外水槽水的交換，使密封部分溶解氧不低于飽和溶解氧濃度的70%。耗氧率的計算公式：MO2=(St-Sb)×60 ×V/m，式中MO2為標準體重的運動代謝率[mg O2/(h·kg)]；St為實驗魚存在時裝置內(nèi)溶解氧量隨時間變化斜率的絕對值；Sb是無魚時裝置內(nèi)溶解氧量隨時間變化斜率的絕對值(細菌耗氧量)；60為常數(shù)(min/h)；V是密封部分水體積(L)；m為魚體重(kg)。耗氧代謝范圍規(guī)定為實驗中獲得的最大耗氧率(MO2,Max)與最小耗氧率(MO2,Min)的差值。

魚組織鎘含量測定：將鰱幼魚用丁香酚溶液(丁香酚溶液/乙醇=1/9，5 mL混合液溶入10 L水中)麻醉(5 min)后，解剖分離出鰓、肝臟、肌肉組織并于-40 ℃保存。之后，稱取肝臟、鰓和肌肉組織，將各組織樣本(以相同處理下12尾魚為一個樣本，分3組，對照組6尾魚)稱量(取濕重)，放置于消解罐(50 mL)中消解[20]，采用原子吸收分光光度計測定組織鎘含量。

1.3 數(shù)據(jù)處理

實驗數(shù)據(jù)在SPSS20.0中進行方差分析(ANOVA)和最小顯著差數(shù)法(LSD)檢驗差異顯著性，顯著性水平為P<0.05。Pearson方法分析臨界游泳速度、耗氧率與鰓、肌肉、肌肉組織鎘含量相關(guān)性。統(tǒng)計數(shù)據(jù)表示為平均值±標準誤(mean±SE)。

2 結(jié)果與分析

2.1 鰱幼魚鰓、肝臟、肌肉組織鎘累積量特征

采用靜水急性毒性試驗法測定鎘暴露對鰱幼魚的毒性，統(tǒng)計鎘暴露24、48、72、96 h鰱幼魚死亡率(圖1)，隨鎘暴露時間的延長和溶液濃度的增大鰱幼魚的死亡率升高，采用直線內(nèi)插法獲得LC50分別為1.75、1.64、1.32、1.14 mg/L，鎘安全濃度系數(shù)為0.1[21]，計算鰱幼魚鎘的安全濃度為0.11 mg/L。與對照組比較，鎘暴露組鰱幼魚鰓(F=6.42；P<0.01)、肝臟(F=15.22；P=0.01)和肌肉(F=10.08；P<0.01)組織中鎘累積量顯著(圖2)。鎘濃度為0.73 mg/L時肝臟中鎘累積量最大。鎘在鰱幼魚組織中的累積量：肝臟>鰓>肌肉。

圖1 鰱幼魚死亡率與水體銅含量和暴露時間的關(guān)系

圖2 鎘暴露后鰱幼魚的鰓、肝臟、肌肉組織鎘含量

a,b,c不同字母表示差異顯著(P<0.05),下同。

2.2 鎘暴露對鰱幼魚臨界游泳速度的影響

鎘暴露對鰱幼魚臨界游泳速度的影響顯著(F=48.88，P<0.05)(圖3)。對照組、0.36、0.73、1.09和1.46 mg/L鎘暴露組對應幼魚臨界游泳速度分別為(7.67±0.28) BL/s、(6.88±0.34) BL/s、(6.51±0.32) BL/s、(6.45±0.32) BL/s和(5.35±0.16) BL/s。隨著鎘濃度增加，鰱幼魚相對臨界游泳速度顯著下降，暴露濃度為1.46 mg/L時，相對臨界游泳速度為對照組的69.75%。

圖3 鎘暴露對鰱幼魚臨界游泳速度的影響

2.3 鎘暴露對鰱幼魚耗氧率的影響

鎘暴露對鰱幼魚代謝范圍影響顯著(F=48.88，P<0.05)，隨著暴露濃度的增加最大耗氧率的增加量先大于最小耗氧率的增加量，然后小于最小耗氧率的增加量，導致耗氧代謝范圍呈先增加后減小趨勢(圖4)。0、0.36、0.73、1.09和1.46 mg/L鎘暴露，對應鰱幼魚耗氧代謝范圍分別為(461.28±24.48)、(496.01±17.26)、(571.73±18.81)、(555.41±47.81)和(534.75±43.80) mg O2/(kg h)。鎘濃度小于0.73 mg/L時，最小耗氧率和最大耗氧率與對照組之間沒有差異。鎘濃度為0.73 mg/L時，耗氧代謝范圍最大，比對照組增加了23.94%。鎘濃度大于0.73 mg/L時，耗氧代謝范圍逐漸降低。

圖4 鎘暴露對鰱幼魚最小耗氧率、最大耗氧率和耗氧代謝范圍的影響

3 討論

實驗中測定了鎘暴露后鰱幼魚鰓、肝臟、肌肉組織中的鎘累積量，并測定了鰱幼魚游泳速度及耗氧率。不同濃度鎘暴露，導致鎘在鰱幼魚組織中的累積量有差異，并對游泳速度和耗氧代謝率產(chǎn)生不同程度的影響。

3.1 鎘暴露鰱幼魚鰓、肝臟、肌肉組織鎘累積量

重金屬在魚組織中的生物富集作用與暴露的濃度、魚類自身的個體差異性、食性以及生存環(huán)境因素均有關(guān)系[22]。重金屬通過體表滲透、鰓呼吸和攝食三種途徑進入魚體，其中鰓是重金屬吸收的重要部位[23]。一般，鎘含量在魚體組織分布規(guī)律為肝臟>鰓>肌肉[24-25]。鰓為呼吸器官，血液含量豐富且與污染物直接接觸，鎘通過鰓頂端細胞膜上的鈣離子通道，進入鰓組織細胞，從而快速累積。肝臟中金屬硫蛋白、類金屬硫蛋白和含氮雜環(huán)小分子化合物的基團和配體等對鎘有很高的親和力和絡合能力，故鎘累積量較高[26]。鯉的鎘暴露實驗表明，隨著暴露時間的延長，暴露組的鰓、肝臟組織中鎘累積量與對照組相比顯著升高[27]。本研究中，鎘暴露組魚體鎘累積量為肝臟大于鰓和肌肉中累積量，研究結(jié)果與文獻報道類似。鎘暴露后鰓和肝臟組織硫蛋白絡合物的含量明顯增加，致使多余的鎘與金屬硫蛋白結(jié)合，并排泄到體外[28]，因此，不同濃度暴露組鰱幼魚組織中鎘累積量差異不顯著。

3.2 鎘暴露對鰱幼魚游泳速度和耗氧代謝范圍的影響

耗氧率是生物生理代謝的重要指標，常用作環(huán)境變化對生物影響的重要指標，對魚類行為測定具有重要的意義[29]。低濃度鎘暴露誘導產(chǎn)生的氧自由基和過氧化物，引發(fā)細胞膜脂質(zhì)過氧化作用，對細胞造成傷害[30]，導致泥鰍(Misgurnusanguillicaudatus)需要消耗大量氧氣來維持受損機體的生理代謝[31]。急性鎘暴露導致斑馬魚呼吸頻率和呼吸強度先升高然后降低[32]。本研究獲得相同的結(jié)果，急性鎘暴露導致鰱幼魚耗氧代謝范圍先升高后降低，鎘濃度為0.73 mg/L時，耗氧代謝范圍為555.41±47.81 mg O2/(kg h)最大，比對照組顯著要高。鎘濃度大于0.73 mg/L時，耗氧代謝范圍受到了抑制，逐漸減小?？赡茉蚴堑蜐舛孺k暴露誘導刺激鰓膜等產(chǎn)生應激性反應，導致鰱幼魚耗氧代謝作用增加。隨著鎘濃度的增加，導致鰓、內(nèi)臟、肌肉等組織損傷，并表現(xiàn)為耗氧代謝降低。

相關(guān)性分析表明，臨界游泳速度與鰓和肌肉組織中鎘累積量呈顯著的負相關(guān)，相關(guān)系數(shù)分別為-0.96 (P=0.01)和-0.90 (P=0.04)，與肝臟組織中鎘累積量相關(guān)性不顯著-0.32 (P=0.60)。鎘暴露會抑制鰓ATPase酶活性，并破壞魚體內(nèi)滲透壓和離子平衡，影響魚類的生理及代謝過程[33]。同時鎘誘導氧自由基導致肌肉線粒體膜損傷，影響線粒體代謝，ATP合成量不足，導致肌絲的滑動受到一定的抑制，最終影響肌肉的收縮運動[34-35]。因此，鎘在鰓和肌肉中濃度的增加，導致鰱幼魚臨界游泳速度降低。而且低濃度鎘暴露引起鰱幼魚體內(nèi)乳酸含量增加，紅細胞和血紅蛋白數(shù)量降低[36]，導致鰱幼魚有氧運動能力降低，無氧運動能力增加，因此臨界游泳速度降低。

3.3 鎘暴露對鰱幼魚的生態(tài)毒性

水體有毒物質(zhì)對魚類的毒性作用分為4個等級：安全濃度<0.1 mg/L，劇毒；安全濃度0.1～1.0 mg/L，高毒；安全濃度1～10 mg/L，中毒；安全濃度>10 mg/L，低毒[37]；中國漁業(yè)水域水質(zhì)標準規(guī)定水體鎘含量應低于0.005 mg/L (GB11607-1989)，對鎘敏感物種急性安全濃度為0.032 mg/L[21]。本研究中，鎘暴露對鰱幼魚的安全濃度為0.11 mg/L，說明鎘對鰱幼魚為高毒物質(zhì)，鰱幼魚對鎘暴露不敏感。但是與其他魚類比較，鎘暴露安全濃度，廣東魴(Megalobramaterminalis)為0.32 mg/L[25]；唐魚(Tanichthysalbonubes)為0.44 mg/L[38]食蚊魚(Gambusiaaffinis)為2.26 mg/L[39]，鰱幼魚對鎘暴露靈敏。急性鎘暴露，鎘濃度<0.73 mg/L時，最小耗氧率變化不顯著，耗氧代謝范圍表現(xiàn)為促進作用，而且臨界游泳速度僅下降了16%，鰱幼魚表現(xiàn)出了一定的耐受性。

4 結(jié)論

鎘對鰱幼魚為高毒物質(zhì)，鰱幼魚對鎘暴露靈敏度高。鎘暴露后鰱幼魚組織內(nèi)的鎘累積量不同，肝臟>鰓>肌肉。鎘暴露導致鰱幼魚耗氧代謝范圍先增加后降低，可能是低濃度鎘暴露誘導鰓等產(chǎn)生應激性，消耗大量氧氣來維持受損機體的生理代謝。耗氧量增加，游泳過程中耗氧效率降低，游泳能力降低。而且鰓和肌肉組織損傷，引起紅細胞和血紅蛋白數(shù)量降低和乳酸含量增加，導致鰱幼魚有氧運動能力降低，臨界游泳速度也會降低。魚對環(huán)境的適應性表現(xiàn)為各種穩(wěn)態(tài)機制和補償機制，污染條件下魚類運動能力調(diào)節(jié)與相關(guān)酶活性變化之間的關(guān)系，魚類對重金屬污染環(huán)境下的適應閾值，環(huán)境的理化因素和污染物之間的相互作用對魚類不同年齡時期行為及代謝的影響等的研究，在實際應用中更具有實際意義，有待進一步研究。

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