魚類肝細胞分離、原代培養(yǎng)與應用

肝臟是動物機體在在物質和能量代謝過程中負有重要作用的器官，其主要功能有：營養(yǎng)代謝、能量存儲、蛋白質合成與分泌和分解毒物等[1]。原代肝細胞培養(yǎng)技術已經被廣泛用于研究肝細胞功能、結構等方方面面，如碳水化合物和氨基酸的代謝[2]。魚類肝細胞的首次體外培養(yǎng)要晚于哺乳動物，Brinbaumb等[3]于1976年用膠原酶灌注法分離了金魚肝細胞，這是魚類肝細胞首次在體外培養(yǎng)，此后，以魚類肝細胞原代培養(yǎng)為對象的研究相繼展開。其研究過程經歷了短期培養(yǎng)[4]、長期培養(yǎng)到建立細胞系并應用于相關領域，目前有關該方面的報道已有250多篇[5]。

1 魚類肝細胞的分離

1907年，Harrison[6]為了研究神經突起的起源問題而進行了一項系統的體外培養(yǎng)活體組織試驗，標志著體外培養(yǎng)技術的創(chuàng)立。魚類組織體外培養(yǎng)技術晚于陸生生物。目前，魚類肝細胞的分離基本上沿用哺乳動物的分離方法，主要方法有組織塊法、機械分散法、酶消化法和二步灌流法［6］。目前魚類肝細胞的分離主要應用二步灌流法和酶消化法[9]。肝細胞在體內具有強大的增殖潛能，在肝臟受損時能夠快速增生，但是肝細胞的體外增殖能力較差，原代培養(yǎng)難以成功，在一定程度上限制了肝細胞培養(yǎng)的廣泛開展，各實驗室對肝細胞分離方法進行了改進，以提高細胞在體外存活時間以及增殖能力。

組織塊法和機械分散法對細胞的損傷較大且多為細胞表面蛋白質的機械性損傷，為不可修復性損傷，導致細胞存活率較低。酶消化法對肝細胞的損傷小，能夠較完整的保存膜蛋白[10]，是目前采用極為廣泛的方法。此法所用的消化酶主要是胰酶或膠原酶，常用的質量濃度是2.5g/L。胡聰[11]將酶法和機械法分離得到的肝細胞進行比較發(fā)現,酶消化法得到的肝細胞功能更強,且形態(tài)和功能維持在正常水平的時間較長。

1976年Seglen[12]在前人的方法基礎上形成了二步灌流法,這是目前國際上流行的肝細胞分離方法,它具有分離效好、細胞產率高、即時存活率高、細胞維持肝特異性功能時間長等特點。具體方法為開腹后注射靜脈注射肝素，作門靜脈和下腔靜脈插管，灌注肝臟獲得單個分離的肝臟細胞。為了肝細胞的最終分離必須用不含Ca2+的螯合劑（如EDTA）預灌注螯合掉肝組織中的Ca2+，打破固定細胞的細胞橋粒樣結構，而后灌注消化酶，充分消化肝組織后，去除肝被膜以及血管，鈍性撕裂肝組織，分離至培養(yǎng)液中，通過離心分離得到純化肝細胞。相對酶消化法而言，二步灌流法收集的細胞多，活力強，易于培養(yǎng)。但是二步灌流法操作復雜、成本較高（需要大量膠原酶）、需要灌注機，并且對于被解剖結構細小的魚類，不適宜用此方法。然而酶消化法操作簡單，不需要用特殊的儀器，可以應用于魚類大多數組織的分離，目前很多研究者已用胰蛋白酶消化法代替二步灌流法分離肝細胞。

肝細胞分離時雜細胞的去除是至關重要的。無論采用何種方法分離肝細胞,都存在肝細胞純化的問題。與酶消化法相比,用組織塊培養(yǎng)得到的細胞中成纖維細胞所占的比率較大，肝組織由肝細胞和其他雜細胞組成(表1)，血細胞和其他組織碎片對肝細胞的培養(yǎng)有一定影響。主要的常用分離方法有差速貼壁法、梯度離心法、Percoll分離技術，因Percoll分離技術代價較大，通常采用低速梯度離心來純化肝細胞[13]。

2 魚類肝細胞的培養(yǎng)以及影響因素

2．1 魚類肝細胞的培養(yǎng)

肝細胞的培養(yǎng)有多種方法[14]（如微囊培養(yǎng)法、微流體通道培養(yǎng)法、雙層膠夾層培養(yǎng)法等），但是由于魚類肝細胞存活率較低不適用懸浮培養(yǎng)，大多數實驗通常采用單層貼壁培養(yǎng)法。。對鯉魚(Cyprinus carpio)[14]的研究表明，細胞接種后12～24h貼壁，細胞形狀從圓形變成扁平。細胞單層貼壁培養(yǎng)受到各種因素的影響，如培養(yǎng)基、細胞培養(yǎng)環(huán)境、血清和各種生長因子。

2．2 影響魚類肝細胞培養(yǎng)的因素

2.2.1肝細胞的來源

供體的選擇對于魚類肝細胞分離與培養(yǎng)十分重要，肝細胞的生長活力程度與生長旺盛程度有關，而大部分魚的生長旺盛程度又與季節(jié)有關，在魚類的生長旺季分離肝細胞成功率較高。取材動物必須健康、生理狀態(tài)良好。有研究［15］認為供體魚的體重、年齡和性別也會影響肝細胞的分離，在大多數試驗中常選用100～200g，年齡較小的魚進行試驗。

2.2.2培養(yǎng)環(huán)境

肝細胞的培養(yǎng)環(huán)境主要包括：溫度、pH值、滲透壓和貼壁環(huán)境。

溫度 魚類肝細胞體外培養(yǎng)的溫度應該與其體內環(huán)境相似，因此魚類肝細胞體外培養(yǎng)的溫度與供體魚的種類有關，溫度對細胞活力的影響可能和細胞細胞膜上不飽和脂肪酸和細胞內蛋白質的合成有關。

pH值 魚類肝細胞培養(yǎng)的最適pH一般為 6.8～7.4。pH值過高或過低，會影細胞內生理生化反應，這一點和哺乳動物一樣。肝細胞體外培養(yǎng)時，緩沖液和CO2的相互作用為細胞創(chuàng)造了穩(wěn)定的pH環(huán)境，NaHCO3溶液和NaH2PO4/Na2HPO4溶液是最常用的緩沖液，濃度一般為4～8mmol/L。

滲透壓 為了模擬與體內相同的環(huán)境，魚類肝細胞體外培養(yǎng)時需提供與體內相似的滲透壓[14]，確保諸如K+、Na+和Cl-等離子的運輸與交換。

貼壁環(huán)境 Segner[9]認為不同的魚類肝細胞貼壁數量不同可能與肝細胞表面特殊的化學物質有關。單層培養(yǎng)過程中，魚類肝細胞在普通的培養(yǎng)皿內很難附著，為提高細胞接種率，通常在細胞培養(yǎng)板底部涂一層基質或者用Falcon Primaria培養(yǎng)板。

2.2.3培養(yǎng)基和血清濃度

不同魚類的肝細胞對營養(yǎng)物質的需求也各有差異，因此所需的培養(yǎng)基不同，但大多數魚類肝細胞培養(yǎng)時用M199或L-15培養(yǎng)基。不同的培養(yǎng)基含氨基酸、無機鹽、維生素等物質比例不同，不同魚類肝細胞培養(yǎng)的最適培養(yǎng)基也不同。研究表明，M199培養(yǎng)基更有利于鯽魚肝細胞貼壁和增殖[15]。然而總體看來，M199與L-15培養(yǎng)基二者哪一個更適合魚類肝細胞體外培養(yǎng)，觀點尚未達成一致。

血清是魚類肝細胞體外培養(yǎng)的添加物之一。血清中含有各種營養(yǎng)物質（增殖因子、附著因子和蛋白質消化阻止因子等），還可以提供多種載體蛋白促進細胞貼壁和生長。胎牛血清或小牛血清較常用于魚類干細胞體外培養(yǎng)基中。不同的魚類肝細胞 對血清的最佳需求也不同，研究表明鯽魚肝細胞在含不同濃度血清的M199 培養(yǎng)基中，細胞的貼壁和增殖都受到不同程度的影響，結果顯示含5%和10% FCS的培養(yǎng)基中細胞貼壁數量最多[15]。Kocal等發(fā)現在無血清培養(yǎng)基中虹鱒肝細胞的貼壁率低于10%，且不能鋪展開[16]。

3 魚類肝細胞體外培養(yǎng)技術的應用

3．1營養(yǎng)學研究

大量研究已經表明體外培養(yǎng)肝細胞可以作為在體培養(yǎng)肝組織模型用于研究，并有著節(jié)約動物數量、縮短試驗時間、排除體內其他因素干擾等優(yōu)點。魚類肝細胞已被作為替代模型研究肝臟代謝功能，如維生素B6對草魚脂代謝的影響[17]，瘦素對黃顙魚肝細胞脂代謝的影響[18]，銅對草魚和黃顙魚肝細胞脂代謝的影響[18]，通過原代培養(yǎng)的魚類肝細胞研究腎上腺素對Ca2+濃度的影響[19]等。

3．2環(huán)境毒理學研究

肝臟具有分解毒物的功能[1]，近年來，在毒性研究和異生物質代謝研究方面，魚類肝細胞已經作為一種模型來研究毒理學。利用體外模型克服了活魚進行毒理學研究周期長、成本高、有一定設備要求等弊端，讓整個實驗進程變得易操作，減少了動物使用量，節(jié)省實驗費用以及時間，并可同時檢測多種物質多個濃度的細胞毒性,為體外高通量篩選模型的建立奠定了基礎[20]。Goksoyr[21]用大西洋鮭肝細胞研究PCB－105、BaP、BNF和重金屬對蛋白質表達的影響，結果顯示多環(huán)芳香烴化合物和重金屬均誘導45 Ku蛋白的表達。多環(huán)芳香烴化合物也會誘導 CYP1A 酶的活性。

3．3疾病學研究

水產養(yǎng)殖業(yè)中，降低水產品死亡率是保證產量的關鍵。從根本上解決和預防水產品病毒病的關鍵是要查清病毒的感染途徑、感染機理以及研制病毒疫苗對水產品進行免疫預防,而建立新的細胞系是進行病毒研究的理想體外研究體系和制備病毒疫苗的有效方法。任秉新[22]將大菱鲆（Scophthalmus maximus）肝細胞進行體外培養(yǎng)并用于疫苗研制，成功研制出具有高度安全性并且可用于大菱鲆預防免疫的TRBIV疫苗。

4 總結

到目前為止，肝細胞分離的實驗動物主要為人、豬、狗、大鼠、小鼠等，其中胚胎、新生動物和成年動物均有報道。世界上約有25000~30000種魚類，然而只有40多種魚的肝細胞被分離和應用，其相關研究較哺乳動物而言起步較晚成果較少，由于研究的需要，創(chuàng)造更高效便捷的肝細胞分離方法以及培養(yǎng)方法，建立不同的魚類肝細胞系是細胞培養(yǎng)繼續(xù)探討的一個方向。

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