利用轉錄組學研究鯉魚脅迫響應機制

導讀

現如今，轉錄組學研究范圍幾乎覆蓋全部的研究領域，包括農林領域，畜牧業(yè)，海洋水產，生物醫(yī)藥，環(huán)境科學，已經成為生物科技研究的必備利器。轉錄組學在農學領域有五大黃金應用方向：生長發(fā)育、脅迫響應、免疫互作、突變表型、品質研究，其中生長發(fā)育和脅迫響應研究項目所占比例最多。隨著三代全長測序技術的出現（如PacBio），轉錄組研究內容變得豐富多彩。通過全長轉錄組測序，我們不僅可以獲得全長序列，還可進行可變剪切、APA、融合基因，新基因的研究，大大豐富了研究內容，提高了論文的質量。

對于無參物種、基因組組裝或注釋不完善的物種，用普通的二代無參轉錄測序，我們將會獲得不好的轉錄本序列信息，注釋和定量結果。對于這種情況，我們可以采用PacBio單樣本全長轉錄組方案設計模式，利用三代獲得全長轉錄本庫，作為二代數據的參考基因組使用，大大提升了數據質量。接下來小編給大家解讀兩篇鯉魚應對脅迫反應機制的成功案例，從實驗方案設計，分析內容，發(fā)表文章IF分數，我們可以充分了解到三代PacBio測序的優(yōu)勢。

英文標題：Effect of ammonia stress on transcriptome and endoplasmic reticulum stress pathway for common carp (Cyprinus carpio) hepatopancreas

中文標題：轉錄組分析揭示氨脅迫對鯉魚肝胰腺內質網應激途徑的影響

發(fā)表雜志：Aquaculture Reports.2021

影響因子：3.216

合作單位：東北農業(yè)大學動物科學與技術學院

DOI：10.1016/j.aqrep.2021.100694

研究材料

普通鯉魚（45.44±2.57 g）取自中國哈爾濱市黑龍江水產研究院呼蘭養(yǎng)魚場。在實驗條件下養(yǎng)殖20天，期間溶解氧、水溫和pH值是：5.0 ± 0.65 mg/L, 23 ± 0.63?C, 7.50 ± 0.81。

試驗方法

一個對照組和一個治療組（96小時氨水脅迫，0.85 mg/LNH3），采樣時間設置為0小時（對照組）、12小時、48小時和96小時（治療組）。其他驗證方法：RT-PCR驗證轉錄組數據一致性性；TUNEL分析和免疫熒光實驗。

測序策略

Illumina HiSeq；取0小時（對照組：L01、L02、L03），氨脅迫96小時（實驗組：L04、L05、L06）作為轉錄組分析，每組3個重復，構建了6個測序文庫。

研究背景

鯉魚是全球養(yǎng)殖最廣泛的魚類。隨著養(yǎng)殖密度的增加，鯉魚養(yǎng)殖面臨著嚴峻的環(huán)境壓力。氨是一個重要的環(huán)境脅迫因素，對繁殖過程產生重大影響。對魚類的毒性作用通常被認為是由NH3引起的，NH3是高度脂溶性的，由于氨在生物體內積累，它很容易通過細胞膜，疾病在鰓、腎和肝組織中，降低免疫力，阻礙生長，甚至死亡。然而，關于致病性和應激的分子機制的基本基因組信息尚不充分。

主要內容

用RNA-seq技術研究氨脅迫下鯉魚肝胰腺的基因表達譜，共有3367個單基因被鑒定為與氨脅迫相關的差異表達基因（DEG）。1724 DEG下調，1643 DEG上調。KEGG分析將這些DEG的代謝途徑分為49個不同的terms。85個DEGs顯著富集在內質網（ko04141）的蛋白質加工途徑中。許多DEG在內質網應激（ERS）途徑和ko04141通路中的未折疊蛋白反應（UPR）信號通路中顯著富集。ERS和UPR通路參與了肝胰腺細胞對氨應激的反應。RT-PCR和轉錄組學結果表明，PERK-eIF2α和IRE1-xbp1通路參與了氨脅迫誘導的肝胰腺細胞對ERS的反應。TUNEL分析結果證實，氨脅迫誘導肝胰腺細胞凋亡。此外，在氨脅迫下，ERS通過PERK-eIF2α-CHOP和IRE1-XBP1-CHOP信號通路誘導肝胰腺細胞凋亡。該文為鯉魚的應激反應提供了新的思路，是首次對氨脅迫下鯉魚肝胰腺轉錄組進行了研究。

部分結果展示

英文標題：Integrative Transcriptomic Analysis Reveals the Immune Mechanism for a CyHV-3-Resistant Common Carp Strain

中文標題：轉錄組分析揭示CyHV-3抗性鯉魚品系的免疫機制

發(fā)表雜志：Frontiers in immunology.2021

影響因子：7.561

合作單位：中國水產科學院黑龍江水產研究所

DOI：10.3389/fimmu.2021.687151

研究材料

德國鏡鯉G4：CyHV-3抗性篩選后的第四代，G4（實驗組）和非抗病育種品系（對照組）用于病毒脅迫。

實驗方法

將患病魚內臟勻漿溶液添加到水箱中，從而誘導CyHV-3感染兩個品系。

測序策略

Illumina測序：實驗組和對照組分別取病毒刺激后第0天和第7天，獲得前腎樣本，每組3個生物學重復。PacBio全長測序：取肝臟、脾臟和腎臟的混合物，各兩生物學重復。

轉錄組分析的策略

研究背景

鯉魚皰疹病毒-3（CyHV-3）感染是鯉魚養(yǎng)殖的主要威脅，可導致鯉魚大量的死亡。CyHV-3可通過削弱宿主的免疫系統(tǒng)而使其死亡，導致其對病原微生物易感性，并可能在感染后6至10天內出現發(fā)病和死亡。感染CyHV-3后存活下來的鯉魚可以抵抗這種病毒未來的感染。由于CyHV-3在鯉魚中存在潛伏期和持續(xù)性攜帶期，遺傳背景對于了解對病毒的耐藥性至關重要。德國鏡鯉品系G4是中國廣泛栽培的鯉魚品系，但因CyHV-3病毒引起高死亡率。然而目前在研究抗CyHV-3免疫機制的詳細免疫系統(tǒng)網絡方面，還缺乏系統(tǒng)的研究。最近的研究表明，lncRNAs在不同類型病原體感染時的廣泛差異表達，表明lncRNAs在魚類免疫反應中起著關鍵作用。然而，在CyHV-3感染期間，鯉魚體內的特異性LncRNA對免疫反應的調節(jié)尚未被研究。第三代測序（如PacBio）可以解碼比第二代測序方法（如Illumina）更長的基因序列，包括mRNA和非編碼RNA在內的更高質量的轉錄本組裝，可能提供對遺傳抗性機制的更詳細理解。在本研究中，為了揭示鯉魚抗CyHV3育種中涉及的免疫機制，使用圖1所示的策略，對CyHV-3激發(fā)期間的mRNA和長非編碼RNA（lncRNA）進行了整合轉錄組學分析。對來自繁殖品系或非繁殖品系的存活鯉魚和健康對照鯉魚的免疫相關轉錄本進行了分析。

研究內容

在CyHV-3感染后第0天和第7天提取鯉魚頭腎組織，并通過Illumina和PacBio測序分析轉錄組。在對涉及的GO term和KEGG途徑進行分析。加權基因共表達網絡分析用于揭示lncRNA對免疫基因的調節(jié)。結果表明，繁殖鯉魚品系通過一種特定的先天免疫機制對CyHV-3感染產生了顯著的抗性,主要的生物學過程是自噬、吞噬、細胞毒性和凝集素和MUC3阻斷病毒。此外，還有免疫抑制信號途徑，如IL21R對STAT3的抑制，PI3K介導的感染時多巴胺對炎癥的抑制，以及NLRC3在穩(wěn)定狀態(tài)下對STING的抑制。從非抗性品系中還發(fā)現了CyHV-3的可能易感因素，如ITGB1、TLR18和CCL4。本研究結果還表明，LncRNA調節(jié)的Nramp和PAI分別促進病毒感染和感染細胞的增殖，而T細胞白血病同源框3(TLX3），以及l(fā)ncRNA的半乳糖凝集素3可能在抗病制中發(fā)揮作用。因此，免疫遺傳不敏感或易受CyHV-3感染的免疫因子已被揭示。

部分結果展示