一株溶藻弧菌H1B6的分離與鑒定

作者：李卓昱1，鮑玉杰1，尚玉曼1，袁增智1,2*

單位：1.天津師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院；2.天津市動植物抗性重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室

簡介：李卓昱，碩士研究生，研究方向：水生生物分子生物學(xué)。*通信作者，講師，從事水產(chǎn)動物病害學(xué)研究。

基金項(xiàng)目：天津師范大學(xué)博士基金資助項(xiàng)目（52XB1412）。

半滑舌鰨（Cynoglossus semilaevis）是我國北方重要的海水養(yǎng)殖魚類，隸屬鰈形目（Pleuronectiformes）舌鰨科（Cnoglossidae）舌鰨屬（Cynoglossus），作為一種深受廣大消費(fèi)者歡迎的魚種，具有較高的經(jīng)濟(jì)食用價值。近年來，各類疾病的出現(xiàn)使半滑舌鰨的健康狀況和養(yǎng)殖事業(yè)受到極大威脅，其中以細(xì)菌性疾病居多。

為進(jìn)一步闡明養(yǎng)殖半滑舌鰨體表潰瘍病病原及發(fā)病機(jī)制，筆者開展了相關(guān)病原菌的篩選工作，并從患潰瘍病的半滑舌鰨體表篩選出一株溶藻弧菌，編號為H1B6，從形態(tài)觀察、生理生化鑒定、Biolog微生物鑒定、16S rDNA序列分析方面對分離菌株進(jìn)行了鑒定，旨在探究其致病性，為今后半滑舌鰨潰瘍病的防控與治療提供一定的科學(xué)依據(jù)。

1

材料與方法

1.1

材料

培養(yǎng)基：TCBS和2216E瓊脂。

試劑：2×TaqPCR Master Mix購自博邁德生物有限公司；生化鑒定管購自杭州微生物試劑有限公司；Biolog GEN Ⅲ 鑒定板購自基因有限公司。

儀器：超凈工作臺（SW-CJ-1FD，江蘇通凈）、高壓滅菌鍋（SX-500，江陰濱江醫(yī)療有限公司）、pH計(jì)（METTER TOLEDO，北京六一儀器廠）、離心機(jī)（Centrifuge5415R Eppendorf）、PCR儀（BIO-RAD）、恒溫培養(yǎng)箱（SPX-150B-D，上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠）、數(shù)顯恒溫水浴鍋（HH-3A型，金壇市金南儀器制造有限公司）、電泳儀（DYY-6C型，北京六一儀器廠）、全自動微生物鑒定系統(tǒng)（MicroStation Biolog）。

試驗(yàn)動物：患病的半滑舌鰨、攻毒用斑馬魚。

1.2

方法

取患潰瘍的半滑舌鰨進(jìn)行病原菌的分離，對分離得到的優(yōu)勢菌株進(jìn)行16S rDNA檢測、生理生化鑒定、Biolog微生物鑒定、斑馬魚攻毒試驗(yàn)。

2

結(jié)果與分析

2.1

病魚臨床癥狀

患體表潰瘍病的半滑舌鰨發(fā)病前期體表出現(xiàn)大量白色潰瘍點(diǎn)，活力減弱，攝食減少。隨著病情的加重，潰瘍面積逐漸增大，可引發(fā)大面積潰爛現(xiàn)象，甚至斷尾，腸道腫大、鼓出，幾乎脫出肛外（圖1），嚴(yán)重時可致死。

圖1 患潰瘍病的半滑舌鰨

2.2

病原菌分離結(jié)果及形態(tài)特征

該試驗(yàn)篩選到一株優(yōu)勢菌株，編號H1B6，革蘭氏染色結(jié)果呈陰性，呈短桿狀（圖2）。

圖2 H1B6菌株的革蘭氏染色結(jié)果

該菌株在2216E培養(yǎng)基上呈1~2mm圓形狀，無色透明，有擴(kuò)散趨勢，有黏性，不易挑起。該菌株在綠色TCBS培養(yǎng)基上為黃色圓形菌落，表面光滑，富有黏性，見圖3。

圖3 TCBS培養(yǎng)基上H1B6菌株的菌落特征

2.3

16S rDNA序列分析及進(jìn)化樹分析

以細(xì)菌DNA為模板，對其進(jìn)行16S rDNA基因的PCR擴(kuò)增，發(fā)現(xiàn)條帶單一，有一條1 500bp左右大小與預(yù)期相符的單一條帶（圖4）。將序列拼接片段在NCBI網(wǎng)站上進(jìn)行BLAST比對，發(fā)現(xiàn)菌株16S rDNA基因?yàn)榛【鷮伲渲信c副溶血性弧菌（序列號為KX860115.1）同源性高達(dá)100%，與溶藻弧菌（序列號為KT986175.1）同源性也高達(dá)100%，由此可初步判定H1B6致病菌為弧菌屬。

注：M.DNA marker；1.16S rDNA

圖4 H1B6菌株16S rDNA序列的PCR擴(kuò)增結(jié)果

與找到的與其同源性較高的序列進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹分析（圖5），結(jié)果顯示H1B6菌株與溶藻弧菌聚為一支。

圖5 H1B6菌株16S rDNA序列系統(tǒng)進(jìn)化樹分析

2.4

生理生化鑒定

生化鑒定結(jié)果（表1）表明，該菌株在3%NaCl中可正常生長，可將葡萄糖分解為丙酮酸，丙酮酸繼續(xù)分解，產(chǎn)生甲酸、乳酸等，在M-R反應(yīng)中呈陽性。對蔗糖、甘露醇、賴氨酸、鳥氨酸的利用呈陽性，不可利用乳糖、精氨酸和硫化氫，V-P反應(yīng)呈陰性。將鑒定結(jié)果與《伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊》中弧菌屬性狀進(jìn)行比較，可確定H1B6菌株與溶藻弧菌最為相似。

2.5

Biolog微生物鑒定結(jié)果

利用GENⅢ鑒定板對菌株H1B6的碳源利用及化學(xué)敏感性進(jìn)行檢測，鑒定結(jié)果如圖6所示。菌株H1B3呈陽性反應(yīng)的有24個，呈陰性反應(yīng)的有42個，呈邊界值反應(yīng)的有30個。碳源利用檢測呈陽性反應(yīng)的有11個，呈陰性反應(yīng)的有36個?；瘜W(xué)敏感性檢測呈陽性反應(yīng)的有13個，呈陰性反應(yīng)的有6個。根據(jù)2個重要的鑒定參數(shù)SIM（相似性）及DIST（距離）可知，當(dāng)SIM越接近于1，則相似性越高；若DIST小于5，即可確定其菌株分類。

圖6 菌株H1B6在GENⅢ鑒定板上的鑒定結(jié)果

Biolog鑒定結(jié)果如表2所示，H1B6菌株為溶藻弧菌的PROB（可能性值）為0.986，SIM和DIST值均在可接受范圍內(nèi)，因此確定H1B6菌株為溶藻弧菌。

2.6

斑馬魚毒力試驗(yàn)結(jié)果

毒力試驗(yàn)結(jié)果如表3所示，腹腔注射6h開始，Ⅲ、Ⅳ組斑馬魚表現(xiàn)出明顯的食欲不振、活力下降、失去方向感，并開始死亡。

觀察死魚發(fā)現(xiàn)其體表充血，魚體泛白，黏液增多，腹部腫脹，尾部呈上翹狀，具有典型的急性細(xì)菌侵染敗血癥病理變化特征，如圖7所示。Ⅳ組12h死亡率達(dá)100%，Ⅲ組24h內(nèi)全部死亡，Ⅱ組累計(jì)死亡率僅為20%，此后再無死亡現(xiàn)象，Ⅰ組和空白對照（CK）組無死亡現(xiàn)象。使用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件建立線性回歸方程y=107x－414286（R2=0.9884），由該公式計(jì)算出H1B6菌株的24h LD50值為4.58×106CFU/mL。

注：A.感染斑馬魚；B.健康的斑馬魚

圖7 感染溶藻弧菌斑馬魚的臨床癥狀

3

討 論

從患病的半滑舌鰨潰瘍體表處篩選到一株H1B6優(yōu)勢菌株，根據(jù)形態(tài)觀察、16S rDNA檢測、生理生化鑒定結(jié)果，H1B6菌株與溶藻弧菌最為接近，而在以16S rDNA序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹模型中，H1B6菌株也與溶藻弧菌菌株聚為一支。Biolog微生物鑒定結(jié)果顯示，H1B6菌株為溶藻弧菌的可能性為98.6%，確定H1B6菌株為溶藻弧菌。斑馬魚攻毒試驗(yàn)結(jié)果顯示，H1B6菌株24h的半數(shù)致死濃度（LD50）為4.58×106CFU/mL。

該研究中也將斑馬魚作為檢驗(yàn)分離菌株毒力的模型。通過人工感染試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，H1B6菌株對斑馬魚具有急性感染能力，毒力較強(qiáng)，提示該菌可能是導(dǎo)致半滑舌鰨體表潰瘍病的病因之一。在此基礎(chǔ)上，今后還需要開展進(jìn)一步的研究工作，以探索該菌株的致病機(jī)制以及對半滑舌鰨的致病力，為半滑舌鰨體表潰瘍病的防治奠定理論基礎(chǔ)。

(安徽農(nóng)業(yè)科學(xué) 2019年05期)