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環(huán)境脅迫對魚類免疫系統(tǒng)影響的研究概況
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王文博，李愛華
（中國科學(xué)院水生生物研究所淡水生態(tài)與生物技術(shù)國家重點實驗室，湖北武漢 430072）
關(guān)健詞：環(huán)境脅迫；魚類；免疫系統(tǒng)
中圖分類號：S931.3 文獻標(biāo)識碼：A
The efect of environmental stress to fish immune system
WANG Wen-bo，LI Ai-hua
(State Key Laboratory of Freshwater Ecology and Biotechnology,Institute of Hydrobiology，Chinese Academy of Sciences, Wuhan 430002, China)
Abstract: Environmental stress can increase the plasma cortisol level of fish and long-term elevation of this hormone in plasma would inhibit immune function, hurt immune organs, increase the susceptibility of fish to pathogens. The munbers of fish lymphocytes decrease after cortisol administration. But when neutrophils, macrophages, non-specific cytotoxic cells, antibody-producing cells and plague-forming cells are concemed，the stress or cortisol administration may activate or suppressed by environmental stress. When fish encounter stress，some parts of immune system of fish may be suppressed immunologically, while the others boosted up as compensation to overcome the stress.
Key words: environmental stress; fish; immune sytstem
環(huán)境脅迫(environmental stress)是指環(huán)境對魚類所處的生存狀態(tài)產(chǎn)生的壓力，可以分為急性環(huán)境脅迫和慢性環(huán)境脅迫。捉撈(handling)和干擾(disturbance)等引起急性環(huán)境脅迫，而水質(zhì)逐漸惡化和高密度放養(yǎng)等造成慢性脅迫[1]。隨著世界人口的增長和消費水平的提高，世界漁業(yè)也得到了長足的發(fā)展。但與此同時，由于人類活動范圍的擴大、程度的加深，環(huán)境資源受到了很大的破壞，環(huán)境對魚類引起的脅迫也日益嚴(yán)重。養(yǎng)殖魚類遭受的環(huán)境脅迫主要有：水質(zhì)惡化(如含重金屬，低溶解氧，富營養(yǎng)化等)、個體間的相互競爭、水溫大幅度變化以及因養(yǎng)殖密度過高而造成的擁擠脅迫等[2]。這些脅迫對魚類可能是直接致死的，而亞致死強度的環(huán)境脅迫可使魚類產(chǎn)生應(yīng)激反應(yīng)(stress)。這雖然是一種保護性反應(yīng)，但持續(xù)地處于應(yīng)激狀態(tài)，機體的特異性和非特異性免疫防御體系的功能會受到抑制，導(dǎo)致魚 體對各類病原敏感性的升高[3,4]。所以，對環(huán)境脅迫的研究，正受到人們的普遍關(guān)注。
魚類免疫系統(tǒng)是魚體執(zhí)行免疫防御功能的機構(gòu)，包括免疫組織及器官、免疫細胞和體液免疫因子三大類。它的主要功能是防御、自身穩(wěn)定與免疫監(jiān)督三個方面。魚類在進行自身免疫保護時，主要行使特異性與非特異性兩大免疫防御功能。
魚類免疫器官， 主要包括胸腺、腎臟和脾臟，粘膜淋巴組織(mucosa-associated lymphoid tissue，MALT)，是重要的免疫組織[5]。免疫細胞可以分為兩大類一類是淋巴細胞，主要是T、B淋巴細胞，參與特異性免疫反應(yīng)，在免疫應(yīng)答中起核心作用一類是吞噬細胞，包括單核細胞、巨噬細胞和各種粒細胞，參與非特異性免疫[6]。體液免疫因子，包括抗體和多種非特異性的免疫因子(如補體、溶菌酶等)[7]。本文將就環(huán)境脅迫對魚類免疫系統(tǒng)的這三個方面的影響來加以綜述。
1 環(huán)境脅迫與血液皮質(zhì)類固醇的產(chǎn)生的關(guān)聯(lián)
業(yè)已明確，環(huán)境脅迫導(dǎo)致的應(yīng)激狀態(tài)下，魚體的血液指標(biāo)發(fā)生一系列的變化，包括血糖、白細胞(包括T、B淋巴細胞、巨噬細胞、嗜中性粒細胞等)、血栓細胞、紅細胞、免疫因子(包括特異性抗體、補體、溶菌酶等)以及激素(如皮質(zhì)類固醇)等等都有不同程度的影響。其中血液皮質(zhì)醇水平的升高是魚類應(yīng)激反應(yīng)的主要特征，甚至用于評估應(yīng)激反應(yīng)的強度。
環(huán)境脅迫與魚體神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)有著廣泛聯(lián)系[8] ，而魚的丘腦下部一垂體一腎間組織軸(hypothalamus-pituitary-interrenal，HPI)，則在這種聯(lián)系中占主導(dǎo)地位。魚體對環(huán)境脅迫產(chǎn)生的應(yīng)激反應(yīng)首先是其下丘腦產(chǎn)生皮質(zhì)類固醇釋放因子(corticotropin releasing factor，CRF)，傳遞給腦垂體、腦垂體受到CRF的刺激，接著分泌促腎上腺皮質(zhì)激素(adrenocorticotropic hormone，ACTH)，并傳遞給腎間組織，最后由腎間組織產(chǎn)生以皮質(zhì)醇為主的皮質(zhì)類固醇，并釋放到血液中去[9]。魚體對環(huán)境脅迫產(chǎn)生的應(yīng)激反應(yīng)最終結(jié)果是導(dǎo)致其血液激素水平升高， 它可以被看做魚類應(yīng)激的一個靈敏信號[10-12]。
需要指出的是，HPI的激活只是魚體對脅迫產(chǎn)生內(nèi)分泌反應(yīng)的一種，脅迫同時也刺激了兒茶酚胺(catecholamine)的釋放[13]，但它對魚類影響的報道遠少于皮質(zhì)醇。Brown等[14]報道注射產(chǎn)生的脅迫可引起魚體血液中甲狀腺素(thyroxine)水平短暫的升高。此外，血糖也會在應(yīng)激之后升高[15]。至于為何當(dāng)魚遇到突發(fā)脅迫時會大量分泌皮質(zhì)醇，Pickering[1]認(rèn)為皮質(zhì)類固醇能促進糖合成[16,17]和脂肪降解[18,19]，這些過程均能產(chǎn)生能量，而這些能量可供給機體用來抵抗脅迫。
基于環(huán)境脅迫與血液皮質(zhì)醇的這種聯(lián)系，很多學(xué)者都是從皮質(zhì)醇與魚體免疫系統(tǒng)的關(guān)系來研究環(huán)境脅迫對魚體免疫系統(tǒng)的影響的。
2 實驗室條件下脅迫方法的建立
有關(guān)環(huán)境對魚類免疫系統(tǒng)影響的研究大都是在實驗室條件下進行的，采用的方法也是多種多樣的。主要有以下幾種:腹腔注射[1,2,20]、擁擠脅迫[21,22]、改變水溫[23-25]、改變pH值[25]、改變水質(zhì)[26,27]、轉(zhuǎn)運捉撈[17,24]、個體競爭[28]。
環(huán)境中存在多種脅迫因素，它們對魚體的作用往往是累加的，單獨研究某種脅迫因素，可能較難全面反映自然環(huán)境對魚體的影響。而血液皮質(zhì)醇水平做為魚類應(yīng)激的一個靈敏信號[10-12]，反映的是各種脅迫因素對魚體的綜合效應(yīng)，對它的研究更有實際意義，也更可行。據(jù)Pickering等[2] 報道，他們以黃油為載體，對虹鱒進行腹腔注射皮質(zhì)醇，以使其在魚體內(nèi)緩慢釋放。結(jié)果顯示血液激素水平升高，且與硬骨魚類對諸如水污染、擁擠脅迫等慢性應(yīng)激反應(yīng)后的激素水平相似，表明這種方法可在一定程度上模擬自然環(huán)境對魚類脅迫的影響，得到許多學(xué)者的認(rèn)同[6,8,9]。
另外，在對魚樣進行采血時，要盡量避免因人為操作而引起魚的應(yīng)激，造成血液皮質(zhì)醇水平升高。通常，在采血前首先要對魚體進行快速地深度麻醉(如100~200mg.L-1MS222)[12,21,22]，也有敲擊魚頭使其在短時間內(nèi)致死的報道[2,24]。Demers等[29]將魚體不經(jīng)轉(zhuǎn)運而直接麻醉于水族箱中，然后再抽血，結(jié)果顯示此過程未引起血液激素水平升高?？傊诓裳獣r要將對魚的人為刺激降低到最小，以免因皮質(zhì)醇升高而對其它指標(biāo)的檢測造成影響。通過皮質(zhì)醇在體內(nèi)、外對魚體免疫系統(tǒng)的研究來間接反映環(huán)境脅迫對魚類的影響，將是本文報道的側(cè)重點。
3 環(huán)境脅迫對魚類免疫系統(tǒng)的影響
3.1 環(huán)境脅迫對魚類免疫組織、器官的影響
哺乳動物在受到環(huán)境脅迫而產(chǎn)生的應(yīng)激過程中會釋放皮質(zhì)類激素，這可能會阻止免疫系統(tǒng)發(fā)揮免疫功能，并且造成對免疫組織的損傷[30]。由于皮質(zhì)醇在環(huán)境對機體免疫器官的影響過程中起介導(dǎo)作用，所以這方面的報道多來自皮質(zhì)醇對魚類免疫器官影響的研究。
Chilonzyk[31] 對虹鱒腹腔注射可的松后，發(fā)現(xiàn)其脾臟細胞比對照減少70%， 胸腺細胞減少60%，腎臟細胞減少50%，表明可的松對這些免疫器官造成了不同程度的損傷。Anderson報道，虹鱒的脾臟在含銅離子的培養(yǎng)基中進行體外培養(yǎng)，其產(chǎn)生的抗體產(chǎn)生細胞數(shù)目比在不含銅離子培養(yǎng)基中培養(yǎng)所產(chǎn)生的要少，可能是銅離子損傷脾臟所致。Ghoneum[33]等將魚浸泡于去氧皮質(zhì)酮(deoxycorticosterone)和皮質(zhì)醇(cortisol)中，對魚的胸腺及其細胞數(shù)量進行了研究，結(jié)果表明,10mg.L-1濃度的皮質(zhì)醇對胸腺無影響，而這個濃度的去氧皮質(zhì)酮卻可使魚致死。低濃度的去氧皮質(zhì)酮(0.01mg.L-1和10mg.L-1) 導(dǎo)致胸腺細胞減少，而高濃度的(1mg.L-1) 則會使胸腺顯著萎縮。郭瓊林[34]用較小劑量的皮質(zhì)醇(15μg.(g.d)-1×2)對草魚進行腹腔注射，發(fā)現(xiàn)頭腎、脾臟、腎臟器官重量指數(shù)明顯減小；頭腎組織中淋巴細胞顯著減少，正常頭腎切片中的一些較大的淋巴細胞群已不復(fù)存在；脾臟組織結(jié)構(gòu)變化基本與頭腎相同，淋巴細胞稀少；腎臟造血組織區(qū)域明顯減小。說明皮質(zhì)醇對這些免疫器官造成了不同程度的損傷。李愛華[35]對草魚在不同放養(yǎng)密度擁擠脅迫10d后的臟器系數(shù)進行研究后，結(jié)果顯示脾臟的臟器系數(shù)顯著降低，且高密度組低于低密度組，這說明擁擠脅迫對脾臟的影響較大，且與擁擠程度相關(guān)〔這一結(jié)果與擁擠脅迫可引起血液淋巴細胞數(shù)量顯著減少的現(xiàn)象是吻合的。
3.2 環(huán)境脅迫對魚類免疫細胞的影響
大量證據(jù)表明，當(dāng)魚體被注射皮質(zhì)醇后，其組織、器官或血液中的T、B琳巴細胞數(shù)量會減少[20,31]，但T、B淋巴細胞對皮質(zhì)醇的敏感度卻存在差異。受脂多糖(LPS)刺激的B淋巴細胞對可的松特別敏感，很易凋亡，而血栓細胞和T淋巴細胞對可的松不是很敏感[36-38]，不論T細胞是否受PHA的激活[38]。Weyts[39]等報道，鯉魚外周血淋巴細胞和頭腎嗜中性粒細胞具有對皮質(zhì)醇高度親和的受體，而皮質(zhì)醇對魚體引起的影響，包括細胞凋亡都是通過這些受體完成的。T、B淋巴細胞對可的松敏感性存在的差異是否是由于皮質(zhì)醇受體不同引起的，還不清楚。
不同器官的淋巴細胞對皮質(zhì)醇的敏感性也是不同的。Kemenade等[41]報道，在體外實驗中，皮質(zhì)醇使鯉魚外周血B淋巴細胞大量凋亡，頭腎、脾B淋巴細胞雖然不像血液B淋巴細胞那樣對可的松敏感，但也引起了凋亡。Tripp等[42]通過可的松對淋巴細胞影響的體外實驗發(fā)現(xiàn)，蛙鱒魚類頭腎和脾的淋巴細胞對可的松的敏感程度不同。頭腎淋巴細胞只在抗體產(chǎn)生早期對可的松敏感，而脾臟細胞則在整個體外培養(yǎng)過程中都對可的松敏感。
多數(shù)研究者認(rèn)為，皮質(zhì)醇在體內(nèi)對淋巴細胞有絲分裂反應(yīng)有抑制作用 [40-42]，但在體外實驗中，卻存在著分歧。Ellsaesser等[42]發(fā)現(xiàn)生理濃度的皮質(zhì)醇只在體內(nèi)實驗中對斑點叉尾鮰的淋巴細胞有絲分裂反應(yīng)有抑制作用，而在體外實驗中沒有此作用，除非用非常高的皮質(zhì)醇劑量。這可能說明皮質(zhì)醇本身對此反應(yīng)并不起直接作用，而是在體內(nèi)間接起作用。而Espelid等[36]對大麻哈魚的體外實驗卻揭示皮質(zhì)醇可抑制淋巴細胞有絲分裂反應(yīng)，這是否與魚的品種不同有關(guān),尚不清楚。
脅迫或可的松處理是否能直接影響魚類巨噬細胞和嗜中性粒細胞，一直有爭議[43]。對于不同硬骨魚，脅迫或可的松可能抑制其活性，也可能激活其活性[37,39,44]。當(dāng)虹鱒生活在2.27mg.L-1的孔雀石綠中一段時間，其外周血紅細胞、血栓細胞、淋巴細胞數(shù)都沒變，嗜中性粒細胞數(shù)明顯降低[45]。Peters等[28]通過在弱勢虹鱒魚群中放養(yǎng)一批能對其生存構(gòu)成威脅的虹鱒頭魚(ranker)進行個體競爭，以此作為脅迫因子，模擬自然環(huán)境中這些弱勢魚群所面臨的被捕食的危機。結(jié)果發(fā)現(xiàn)應(yīng)激的弱勢魚血液中吞噬細胞被嚴(yán)重破壞，而且從組織和血液中再分離出細菌的數(shù)量也高。另外一些研究表明,經(jīng)皮質(zhì)醇處理的魚的巨噬細胞活性被抑制[46]。但是，也有環(huán)境脅迫或皮質(zhì)醇激活吞噬細胞活性的報道。Weyts等[38]的體內(nèi)、體外實驗均表明可的松未影響鯉魚嗜中性粒細胞呼吸暴發(fā)活性，但在體外可抑制其凋亡，并提出這一作用可能是由存在于嗜中性粒細胞表面的糖皮質(zhì)類固醇受體介導(dǎo)的。在急性應(yīng)激情況下，血液可的松可促進嗜中性粒細胞的產(chǎn)生,構(gòu)成機體抵抗病原微生物入侵的第一道防線[43]。Peters等[47]的研究結(jié)果似乎可支持上述觀點，即當(dāng)虹鱒受來自環(huán)境突變脅迫而處于應(yīng)激狀態(tài)時，吞噬細胞變得活躍，表現(xiàn)為細胞肥大，伸出偽足，自我吞噬率加強，體內(nèi)和體外的吞噬酵母細胞實驗也顯示其吞噬率加強。用鹽水腹腔注射虹鱒而使其應(yīng)激，引起脾和頭腎巨噬細胞吞噬活性下降，而用可的松注射時卻抑制了活性的下降[48]。實際上，可的松被報道可阻止人類嗜中性粒細胞的凋亡[49,50]。這表明在哺乳動物中，可的松不只是抑制免疫，另一方面，它也能對某些免疫功能起積極作用。從上面的報道也可以看出，在魚類中存在著類似的情況。
硬骨魚類的非特異性細胞毒細胞(NCC)在系統(tǒng)發(fā)生上可能是哺乳動物自然殺傷細胞(NK)的前體，它能溶解多種人類和老鼠的瘤細胞，也能對一些魚的寄生原蟲起殺傷作用[51]。Morvan等[23]報道，低溫(12±0.5)℃ 增強了鯰魚的非特異性細胞毒細胞（NCC）的活性，而減少了抗體的生成，高溫(28±0.5)℃ 則對以上指標(biāo)無影響。這表明在低溫條件下，雖然魚的特異性免疫功能受到了抑制，但非特異性免疫功能卻代償性的得到了增強。
此外，環(huán)境脅迫或皮質(zhì)醇對魚體體外空斑形成細胞(plaque-forming cells，pfcs)和抗體生成細胞(antibody-processing cell，APC) 的產(chǎn)生數(shù)量也有影響。擁擠脅迫使亞特蘭大經(jīng)魚血液激素水平升高，同時減少了體外空斑形成細胞的生成數(shù)量[28]，說明高放養(yǎng)密度抑制了魚的免疫系統(tǒng)。其結(jié)果與Maule等[20,52]的體外實驗結(jié)果相一致。Kaattari等[53]的體外實驗結(jié)果也表明皮質(zhì)醇阻止了抗體分泌細胞前體向成熟的空斑形成細胞的轉(zhuǎn)變。經(jīng)皮質(zhì)醇處理的魚，其體內(nèi)抗體生成細胞的數(shù)量會減少[21]。但另外也有一些學(xué)者發(fā)現(xiàn)，皮質(zhì)醇處理鮭鱒后，其產(chǎn)生抗體生成細胞的數(shù)量和抗病力方面均與對照魚沒有顯著差異[54,55]。事實上，脅迫對魚的影響因魚的種類、脅迫手段、強度及采樣所用的時間和方法等諸多因素的限制，研究所得出的結(jié)論可能會不一致，甚至是相反的[36]。
3.3 環(huán)境脅迫對魚類體液免疫因子的影響
有關(guān)這方面的研究，多數(shù)學(xué)者的結(jié)果表明環(huán)境脅迫或皮質(zhì)醇處理可減少魚體產(chǎn)生特異性抗體的數(shù)量[20,56,57]。但也有少數(shù)學(xué)者得到了不同的結(jié)果。例如，Espelid等[36]認(rèn)為反復(fù)的捉撈大麻哈魚并沒有影響其特異性抗體產(chǎn)生的能力，這也許是由于脅迫的強度不足以引起魚的應(yīng)激或是大麻哈魚已適應(yīng)了脅迫。Thurvander[58]發(fā)現(xiàn)用鰻弧菌免疫的虹鱒置于含錫(13.6μg.L-1) 水體中周后，對抗原的細胞免疫反應(yīng)低于對照組，但體液抗體的滴度高于對照組，可能是鎘抑制了T細胞而對B細胞沒有影響。還有學(xué)者認(rèn)為高度應(yīng)激的魚抗體產(chǎn)生能力高于低度應(yīng)激的魚的[59]此外，溫度對魚體特異性免疫功能的影響也不容忽視。Hrubec等[60]報道，當(dāng)狼鱸在10℃和18℃水中時，其對殺鮭氣單胞菌A.salmonicida的抗體反應(yīng)在發(fā)生時間上延遲了，反應(yīng)的程度也有所下降；在高于其最適溫度的29℃時，抗體不受影響。類似地,Sommer 等[61]發(fā)現(xiàn)，虹鰭在10℃時的特異性抗體滴度比15℃時的低，而20℃時的要比15℃的高。表明在最適溫度下抗體水平達到最高，在適宜溫度范圍內(nèi)，抗體滴度隨溫度升高而增高。
據(jù)報道，在一定條件下，魚體血液中的溶菌酶可能是比皮質(zhì)醇更可靠的應(yīng)激信號，但溶菌酶水平升高所持續(xù)的時間依脅迫的方法和強度而定[59]。強度較弱的脅迫，比如30分鐘的捉撈，可使虹鱒的溶菌酶活性得到加強或是抑制，而高強度的脅迫，比如2h的連續(xù)運輸(transportation)或急性水質(zhì)污染可明顯減少溶菌酶活性[15]。Sovenyi等[62]將鯉魚浸泡于含鎘(5mg.L-1)的水體中，96h后發(fā)現(xiàn)其腎臟溶菌酶水平不到對照魚的一半。Rotllant等[63]進行的實驗表明，在經(jīng)歷了23d的擁擠脅迫后，紅色棘髭魚(Pagrus pagrus)的溶菌酶含量在16d后明顯升高并持續(xù)到第23d，而替代途徑補體法性ACH50值(50% hemolytic unit of alternative complement)明顯下降。另外，Ortuno等[64]將海鯛在100kg.(m3)-1的密度下放養(yǎng)2h，也發(fā)現(xiàn)血清補體活性明顯下降；擁擠脅迫5d后，補體替代途徑(alternative complement pathway，ACP),水平下降，15d后恢復(fù)到正常水平[15]。就以上結(jié)論來看，似乎說明擁擠脅迫對補體大多有抑制作用。Fevolden等[59]用虹鱒做的關(guān)于魚類應(yīng)激的實驗表明，高度應(yīng)激的魚在溶菌酶活性和抗體產(chǎn)生水平方面均高于低度應(yīng)激的魚，但攻毒后的死亡率也較高。這可能是由于諸如血清補體溶菌活性等其它防御機制受到抑制而引起的。脅迫使補體活性下降，表明其對魚體免疫系統(tǒng)有一定抑制作用；另一方面，溶菌酶活性升高是機體在經(jīng)歷了一段應(yīng)激之后而產(chǎn)生的一種保護機制，借此維持機體的自身平衡來克服脅迫。我們做的皮質(zhì)醇對螂魚血清溶菌酶和補體影響的體外實驗中，未發(fā)現(xiàn)皮質(zhì)醇對這兩者有何抑制作用，可能是因為皮質(zhì)醇本身對它們并無作用，而是在體內(nèi)間接起作用的緣故。
4 小結(jié)
環(huán)境脅迫使魚體血液皮質(zhì)醇水平升高[65]，短時間的升高可以使魚對抵抗危及生命的脅迫發(fā)揮積極作用。但很多環(huán)境脅迫都是慢性的，可以引起血液激素水平長時間升高[2]。這將會導(dǎo)致魚體重下降，生長減緩[66]，對疾病敏感性增加[2,4,45]。外源皮質(zhì)醇導(dǎo)人魚體后，也可改變其免疫器官的形態(tài)[31]，抑制免疫功能[57]，減少對疾病的抵抗力[2]。但是,環(huán)境脅迫對魚類免疫系統(tǒng)影響的很多內(nèi)在機理尚不清楚，比如為什么血液皮質(zhì)醇水平的升高會引起免疫系統(tǒng)及免疫功能的改變，以及這些變化是否就是導(dǎo)致魚體對疾病敏感性升高的主要原因，等等。要解決因環(huán)境脅迫而引起魚病頻發(fā)的問題，這些都有待做進一步的研究。
參考文獻（略）
文章選自《水產(chǎn)學(xué)報》，2002,26(4):368~374
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