史氏鱘精子保存方法比較分析

精液超低溫冷凍保存技術(shù)的研究始于２０世紀(jì)５０年代，此項(xiàng)技術(shù)發(fā)展至今已取得很大成就［１］。目前，鱘類精液超低溫冷凍保存雖然已取得了顯著的成果，國內(nèi)外有一些成功的報(bào)道，部分種類可以應(yīng)用于實(shí)驗(yàn)室中冷凍庫的建立，以及在種質(zhì)資源保存上發(fā)揮重要作用，但大多數(shù)鱘類的精子解凍后只獲得有限的孵化率，這種狀況影響了此項(xiàng)技術(shù)在生產(chǎn)上的推廣應(yīng)用［２－３］。史氏 鱘 （Ａｃｉｐｅｎｓｅｒ　ｓｃｈｒｅｎｃｋｉｉ）屬 鱘 形 目、鱘屬，原產(chǎn)于黑龍江流域，為主要的淡水養(yǎng)殖品種之一［４］。為了解決鱘魚人工繁殖中雌雄性腺發(fā)育不同步及雄魚不足的問題，筆者于２０１０年４月以史氏鱘精子為材料進(jìn)行了超低溫冷凍保存和凍精人工授精試驗(yàn)，旨在驗(yàn)證經(jīng)過冷凍保存史氏鱘精子的授精能力，摸索出一套有效的鱘魚精子超低溫冷凍保存方法和凍精授精技術(shù)，為瀕危、珍稀鱘魚種質(zhì)資源保存及生物多樣性的保護(hù)應(yīng)用提供參考與借鑒。

１　材料與方法

１．１　材料

史氏鱘精卵均來源于從黑龍江引進(jìn)、中華鱘研究所人工培育達(dá)性成熟的親本，采用促黃體釋放激素類似物（ＬＲＨ－Ａ２）對成熟的雄魚和雌魚進(jìn)行注射催情，采取擠壓法采集精子和卵子。顯微鏡下觀察精子激活率＞（７５．０±４．５）％，ｐＨ計(jì)（上?？祪x儀器有限公司生產(chǎn)）經(jīng)校正后測定史氏鱘精液ｐＨ值為８．０４。將采集到的干凈無水精液按６０～８０ｍＬ的量分裝保鮮袋充氧，置于２～４℃培養(yǎng)箱冷藏，經(jīng)超低溫冷凍直接投入液氮中保存，５ｈ后凍精解凍與產(chǎn)出的史氏鱘成熟卵進(jìn)行人工授精。試驗(yàn)所用精卵分別來自同一組雄雌魚。

１．２　方法

１．２．１　冷凍精子稀釋液及激活液

參照文獻(xiàn)［２］二步降溫法篩選步驟及前期開展的鱘魚精子超低溫冷凍保存試驗(yàn)數(shù)據(jù)，選取濃度為：Ｔｒｉｓ?。玻埃恚恚铮欤?、ＫＣｌ?。埃怠玻恚恚铮欤毯停樱酰悖颍铮螅濉。常啊保埃埃恚恚铮欤膛渲茲舛忍荻认♂屢?，加入終體積分?jǐn)?shù)為８％的甲醇作為抗凍劑，對稀釋液進(jìn)行預(yù)篩選，得出３個(gè)保存效果較好的稀釋液配方（表１）用于精子超低冷凍保存和人工授精試驗(yàn)。激活液（Ｄ）配方為：Ｔｒｉｓ　１０ｍｍｏｌ／Ｌ，ＮａＣｌ?。保埃恚恚铮欤?，２５ｍｍｏｌ／Ｌ?。牵欤?，ｐＨ?。福啊?/span>

１．２．２　精子冷凍及解凍

取活力大于７０％的鮮精，按１∶２分別與２～４℃的各個(gè)配方的抗凍稀釋液混合，分裝２ｍＬ凍存管，采用二步降溫法，即距液氮面上２～３ｃｍ處平衡１０ｍｉｎ后，直接投入液氮中冷凍保存，３８℃水?。玻恚椋罱鈨觥?/span>

１．２．３　精子活力評價(jià)方法

用一次性注射器針頭蘸取等量精液與在載玻片上的井水混合，用針頭攪散，立即在顯微鏡下觀察精子的運(yùn)動(dòng)情況，以視野內(nèi)活動(dòng)精子占精子總數(shù)的百分比［５－７］，即精子用激活率（％）來評價(jià)精子活力?；盍z測由同一個(gè)人完成，每樣重復(fù)３次。

１．２．４　凍精人工授精

雌鱘催情達(dá)效應(yīng)時(shí)間，輕壓腹部能擠出卵或產(chǎn)卵時(shí)開始解凍冷凍精子，同時(shí)采卵。每樣每１０ｍＬ卵子加入３ｍＬ解凍精子快速混合，隨即加入激活液或井水５ｍＬ，柔和攪拌２０ｓ后，加入井水５ｍＬ攪拌１ｍｉｎ，用井水沖洗２次，放入加有２０％～２５％滑石粉孵化篩，靜水增氧脫粘７０ｍｉｎ，流水孵化。以鮮精人工授精作對照組。孵化水溫１５．７～１９．９℃，溶解氧７．０～７．６ｍｇ／Ｌ。胚胎發(fā)育至原腸期后統(tǒng)計(jì)受精率（受精率＝原腸期胚胎數(shù)／卵粒總數(shù)×１００％）和仔魚出膜后統(tǒng)計(jì)孵化率（孵化率＝孵出仔苗數(shù)／卵?？倲?shù)×１００％）。

１．３　統(tǒng)計(jì)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用ＳＰＳＳ　１１．０進(jìn)行分析。

２　結(jié)果與分析

２．１　解凍精子的激活情況

３種稀釋液保存的精子，解凍后鏡檢激活率分別為（３８．２±１．５）％、（３５．８±３．２）％、（５２．３±３．５）％（見表２）。配方Ⅰ和Ⅱ之間差異不顯著（Ｐ＞０．０５），而配方Ⅰ、Ⅱ與 配方Ⅲ差 異顯著 （Ｐ＜０．０５）。凍精與鮮精相比活力明顯下降。

２．２　解凍精子的受精率

解凍精子采用激活液和井水為介質(zhì)與卵受精，受精率見表２。由表２可見，配方Ⅰ、Ⅱ井水受精率要稍高于激活液，配方Ⅲ激活液受精率要高于井水，但差異均不顯著。凍精試驗(yàn)組配方Ⅲ獲得最佳受精率，但與對照組差異顯著。

２．３　凍精受精卵的孵化率

對照組孵化率最高。凍精試驗(yàn)組卵受精的孵化率，配方Ⅰ、Ⅱ與受精率呈現(xiàn)相同規(guī)律，配方Ⅲ則激活液要高于井水（見表２）。

３　討論

３．１?。耍珜鼍盍Φ挠绊?/span>

有研究認(rèn)為鱘魚精子在形態(tài)、生理、生化上與淡水硬骨魚類有很大不同，鱘魚精子對Ｋ＋最敏感［２］。本次試驗(yàn)結(jié)果顯示配方Ⅰ與配方Ⅱ的區(qū)別在于Ｋ＋濃度。從受精率和孵化率比較，在保存效果好的稀釋液中，１～２ｍｍｏｌ／Ｌ，低濃度Ｋ＋比高濃度Ｋ＋對鱘魚精子保存有利。

３．２　滲透壓對凍精活力的影響

大多 數(shù) 硬 骨 魚 類 精 液 滲 透 壓 為２５０～３００ｍｏｓｍｏｌ／ｋｇ，鱘 魚 類 偏 低，史 氏 鱘 為３５ ～ ４５ｍｏｓｍｏｌ／ｋｇ，而 甲 醇 對 稀 釋 液 的 滲 透 壓 影 響 不大［３］。本次試驗(yàn)中配方Ⅰ、Ⅱ的滲透壓相對于史氏鱘精液滲透壓較接近，而配方Ⅲ相對偏高，獲得了最佳激活率。一般認(rèn)為，高滲溶液能夠有效脫去精子內(nèi)的水分，以免在快速降溫過程中形成結(jié)晶導(dǎo)致精子破裂，從而利于精子的保存。本次試驗(yàn)結(jié)果表明，滲透壓為５２～８２ｍｏｓｍｏｌ／ｋｇ，高滲稀釋液有利于史氏鱘精子的保存。

３．３　激活—授精對受精率和孵化率的影響

配方Ⅰ、Ⅱ井水受精率要稍高于激活液，配方Ⅲ激活液受精率要高于井水，但差異均不顯著。凍精試驗(yàn)組配方Ⅲ獲得最佳受精率。結(jié)果表明：精子活力與精子受精率成顯著正相關(guān)［３，６］。即解凍精子活力高，其受精率高。凍精試驗(yàn)組卵受精的孵化率，配方Ⅰ、Ⅱ與受精率呈現(xiàn)相同規(guī)律，配方Ⅲ則激活液高于井水，結(jié)果顯示：解凍精子的受精率高并不一定意味著孵化率高。這可能是因?yàn)槌釉诶鋬霰４孢^程中引起精子結(jié)構(gòu)和功能的不同程度損傷外［８］，抗凍稀釋液的作用及冷凍解凍的處理，使精子本身的滲透壓也發(fā)生了變化，在激活授精過程中，隨著滲透壓差的調(diào)節(jié)，精子吸水膨脹或脫水，致使精子在冷凍保存后雖然還保留著較好的授精能力，但部分受精卵不能發(fā)育成正常的胚胎。所以在科研生產(chǎn)應(yīng)用中除了優(yōu)化改進(jìn)精子冷保存技術(shù)，降低精子冷凍損傷外，其中解凍精子的激活授精方法是影響凍精受精率和孵化率的關(guān)鍵因素之一。