口服酵母多糖對(duì)異育銀鯽抗“鰓出血”病原感染的作用

          口服酵母多糖對(duì)異育銀鯽抗“鰓出血”病原感染的作用

              陳昌福 ^[1] 胡明 ^[1] 方蘋(píng) ^[2] 陳輝 ^[2] 劉訓(xùn)猛 ^[2] 袁銳 ^[2]
                   [1]華中農(nóng)業(yè)大學(xué)   ^[2]江蘇省漁業(yè)技術(shù)推廣中心
   核心提示：本文探討了口服酵母多糖對(duì)異育銀鯽體內(nèi)免疫相關(guān)物質(zhì)活性與人工感染“鰓出血”病原抗病力的影響，試驗(yàn)結(jié)果證明酵母多糖可提高供試異育銀鯽體內(nèi)免疫相關(guān)物質(zhì)的活性，也可增強(qiáng)異育銀鯽抵抗“鰓出血”病原感染的能力，對(duì)魚(yú)類(lèi)的生長(zhǎng)、體色等無(wú)不良影響。
    本文探討了口服酵母多糖對(duì)異育銀鯽體內(nèi)免疫相關(guān)物質(zhì)活性與人工感染“鰓出血”病原抗病力的影響，試驗(yàn)結(jié)果證明酵母多糖可提高供試異育銀鯽體內(nèi)免疫相關(guān)物質(zhì)的活性，也可增強(qiáng)異育銀鯽抵抗“鰓出血”病原感染的能力，對(duì)魚(yú)類(lèi)的生長(zhǎng)、體色等無(wú)不良影響。本試驗(yàn)由江蘇省水產(chǎn)三新工程項(xiàng)目（編號(hào)：D2013-5-1）資助。
 
    數(shù)十年來(lái)，利用各種抗生素類(lèi)藥物或者化學(xué)藥物防控養(yǎng)殖魚(yú)類(lèi)的傳染性疾病是常用的措施。但是，藥物引起的病原菌耐藥性和養(yǎng)殖水體中微生態(tài)環(huán)境失衡等問(wèn)題，已經(jīng)逐漸成為水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)中日益嚴(yán)峻的問(wèn)題。為了避免采用藥物防治養(yǎng)殖魚(yú)類(lèi)的傳染性疾病引起的各種問(wèn)題，國(guó)內(nèi)、外的研究者在利用免疫刺激劑預(yù)防養(yǎng)殖魚(yú)類(lèi)傳染性疾病方面，也已經(jīng)做了不少研究工作。目前，在國(guó)外已經(jīng)有不少種類(lèi)的免疫刺激劑正在水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)中應(yīng)用。
 
    本研究利用安琪酵母股份有限公司生產(chǎn)的酵母多糖投喂異育銀鯽（Carassius auratus gibelio）后，檢測(cè)了供試異育銀鯽體內(nèi)免疫相關(guān)物質(zhì)活性的變化與抵抗人工感染“鰓出血”病原的能力。
 
    1材料與方法
 
    1、供試異育銀鯽與飼養(yǎng)條件試驗(yàn)在鹽城裕達(dá)水產(chǎn)養(yǎng)殖場(chǎng)池塘中設(shè)置的網(wǎng)箱中進(jìn)行。將來(lái)源相同、活潑無(wú)外傷的體重為（113.5±5.5）g的異育銀鯽，仔細(xì)挑選規(guī)格相近的放在同一個(gè)網(wǎng)箱中飼養(yǎng)。在同一個(gè)池塘中放置的30個(gè)條件相同網(wǎng)箱中選擇的7個(gè)網(wǎng)箱（分別作為Ⅰ-Ⅶ組），每個(gè)4.0m×4.0m×1.5m的網(wǎng)箱內(nèi)飼養(yǎng)500尾異育銀鯽（圖1），在試驗(yàn)期間溫度變化在17.5-25.5℃之間。每天上午8:00、中午13:00和下午16:30各投喂餌料1次，投餌量以使異育銀鯽達(dá)到飽足并有少量剩余為準(zhǔn)。所用飼料為惠裕飼料科技有限公司生產(chǎn)的異育銀鯽專用飼料。
 
    2、酵母多糖用于本研究的免疫增強(qiáng)劑是安琪酵母股份有限公司以醫(yī)藥專用酵母生產(chǎn)的福邦牌酵母多糖，該產(chǎn)品中含有的β-葡聚糖≥20%，α-甘露聚糖肽≥20%，肽類(lèi)及蛋白質(zhì)≥30%，幾丁質(zhì)≥2.0%。
 
    3、酵母多糖投喂劑量與程序根據(jù)各組試驗(yàn)異育銀鯽的總體重，在定量的飼料中添加不同劑量的酵母多糖，制作成內(nèi)含不同水平的酵母多糖的顆粒飼料后分別投喂Ⅰ-Ⅵ組試驗(yàn)異育銀鯽，即自I號(hào)至Ⅴ號(hào)網(wǎng)箱的投喂免疫增強(qiáng)劑的劑量分別為100 mg/kg.B.W、200.0 mg/kg.B.W、300.0 mg/kg.B.W、400.0 mg/kg.B.W、500.0 mg/kg.B.W和600.0 mg/kg.B.W。Ⅶ號(hào)網(wǎng)箱的試驗(yàn)異育銀鯽則投喂未添加酵母多糖的飼料，作為對(duì)照組。每天投喂相當(dāng)于魚(yú)體重2.5%的飼料，連續(xù)投喂28d。
 
    4、采血于免疫接種并投喂添加酵母多糖飼料后的第29d，從各組中分別隨機(jī)撈取15尾供試異育銀鯽，對(duì)其斷頭取血。將每尾魚(yú)的血液分為2份，其中1份以肝素抗凝，制備抗凝血，供檢測(cè)白細(xì)胞吞噬活性；將另一份血液首先在室溫下靜置1 h待其凝固，置4℃冰箱保持4 h后，于4℃條件下以4000 r/min離心10 min，收集上層血清，保存在4℃冰箱中，備用。
 
    5、在0.2 mL抗凝血中加入0.1 mL 福爾馬林滅活的金黃色葡萄球菌，搖勻，在25℃的恒溫水浴鍋中孵育45 min，每隔10 min搖動(dòng)1次。用吸管吸取血細(xì)胞涂片，每個(gè)樣品涂5張，用甲醇固定10 min，Giemsa染色液染1 h，水洗風(fēng)干后，鏡檢，并依下式計(jì)算白細(xì)胞吞噬百分比（phagocytic percentage，PP）和吞噬指數(shù)（phagocytic index，PI）。
 
    吞噬百分比（PP） =（100個(gè)吞噬細(xì)胞中參與吞噬的細(xì)胞數(shù)/100）×100
 
    吞噬指數(shù)（PI ）= 細(xì)胞內(nèi)總菌數(shù)/參與吞噬的細(xì)胞數(shù)
 
    6、溶菌酶活性的測(cè)定用0.067mol/L的磷酸緩沖液（PBS，pH 6.4）將溶壁微球菌（Micrococcus lysoleikticus）配制成0.2 mg/mL 的菌懸液。每個(gè)樣品取3.0 mL菌懸液，吸取血清0.04 mL加入到菌懸液中，混勻后，立刻在540 nm下測(cè)定A。值。然后在28℃水浴中溫育30 min，取出后置于4℃冰浴終止反應(yīng)，再測(cè)定A值。計(jì)算溶菌酶活性單位：U = （A。- A）/ A 。
 
    7、血清中谷丙轉(zhuǎn)氨酶活性的測(cè)定采用谷丙轉(zhuǎn)氨酶試劑盒（上海科欣生物技術(shù)研究所產(chǎn)品，批號(hào)：20140706）測(cè)定。
 
    8、血清中總蛋白含量的測(cè)定采用血清總蛋白試劑盒（上?？菩郎锛夹g(shù)研究所產(chǎn)品，批號(hào)：20140711）測(cè)定。
 
    9、攻毒從試驗(yàn)和對(duì)照組網(wǎng)箱中隨機(jī)各撈取50尾供試異育銀鯽，放養(yǎng)在盛水2.0M3的圓形塑料水族箱中充氣飼養(yǎng)。在每個(gè)水族箱中放置5尾體重300.0g左右的具有“鰓出血”典型癥狀的病魚(yú)，與50尾供試魚(yú)同居飼養(yǎng)2d后將其撈出，將供試魚(yú)繼續(xù)飼養(yǎng)觀察21d。對(duì)在此期間死亡的異育銀鯽進(jìn)行解剖觀察，判斷是否由于感染“鰓出血”疾病而致死，統(tǒng)計(jì)各組的死亡率，依下式計(jì)算相對(duì)免疫保護(hù)率（Relative percent survival，RPS）。
 
    免疫保護(hù)率（RPS）= [1-（免疫組死亡率/對(duì)照組死亡率）]×1002
 
    結(jié)果
 
    1、溶菌酶活性和白細(xì)胞吞噬活性的變化投喂添加酵母多糖的飼料后，對(duì)照和試驗(yàn)組異育銀鯽的血清溶菌酶活性和白細(xì)胞吞噬活性的測(cè)定結(jié)果。投喂酵母多糖的試驗(yàn)組異育銀鯽的血清溶菌酶活性顯著高于對(duì)照組（t測(cè)驗(yàn)，P<0.05）。白細(xì)胞吞噬活性的測(cè)定結(jié)果表明，試驗(yàn)魚(yú)體白細(xì)胞的PP和PI均極顯著地高于對(duì)照組（t測(cè)驗(yàn)，P<0.01）。
 
     2、血清總蛋白和SGPT活性的變化供試異育銀鯽的血清中總蛋白含量和SGPT活性測(cè)定結(jié)果。添加免疫多糖的試驗(yàn)組魚(yú)體的血清中總蛋白含量有所提高，但是，對(duì)照與試驗(yàn)組異育銀鯽血清中蛋白含量并未出現(xiàn)顯著性差別（t測(cè)驗(yàn)，P>0.05）。對(duì)SGPT活性的測(cè)定結(jié)果表明，在飼料中添加酵母多糖可以降低魚(yú)體血清中SGPT的活性，但是，試驗(yàn)與對(duì)照組異育銀鯽之間也并未出現(xiàn)顯著性差異（t測(cè)驗(yàn)，P>0.05）。 
 
    3、攻毒后的存活率 對(duì)照及試驗(yàn)魚(yú)在與典型病魚(yú)同居感染攻毒后，各組的死亡情況可以看出，經(jīng)過(guò)投喂酵母多糖的異育銀鯽均獲得了一定的RPS，而在飼料中添加酵母多糖的試驗(yàn)組異育銀鯽死亡率明顯的低于未添加酵母多糖的對(duì)照組，與對(duì)照組相比，當(dāng)酵母多糖酵在飼料中的添加量為500.0 mg/kg.B.W.時(shí)，受免異育銀鯽的獲得了最高的RPS，但是，各個(gè)添加酵母多糖的試驗(yàn)組之間的RPS則未出現(xiàn)顯著性差別（t測(cè)驗(yàn)，P>0.05）。
 
    討論
    關(guān)于異育銀鯽的“鰓出血”病，研究者們已經(jīng)用不同的方法證明了其病原是病毒。而對(duì)于魚(yú)類(lèi)的病毒性疾病，目前尚無(wú)有效的藥物可以治療。本試驗(yàn)結(jié)果證明了酵母多糖對(duì)這種病毒病是具有預(yù)防作用的。本研究結(jié)果不僅證明了酵母多糖對(duì)供試異育銀鯽的幾種免疫相關(guān)物質(zhì)的活性具有刺激作用，而且采用將供試魚(yú)與典型病魚(yú)同居感染的方式，證明了供試魚(yú)是具有提高試驗(yàn)魚(yú)抵抗病原感染的作用的。
    6個(gè)不同劑量對(duì)供試異育銀鯽血清中幾種免疫相關(guān)物質(zhì)活性的差別均不是很明顯，說(shuō)明在異育銀鯽的餌料中酵母多糖的添加量以100.0-600.0 mg/kg.B.W.均具有一定的作用。
 
    至于添加有酵母多糖餌料的投喂時(shí)間究竟以連續(xù)多長(zhǎng)時(shí)間為宜，以及在飼料中酵母多糖的最適宜添加量等，尚需要進(jìn)一步研究。
      (2015, (6))