受精過程中與卵膜硬化相關(guān)的細(xì)胞和分子修飾

摘要

受精是一個(gè)重要的過程，是生命的起始，可從本質(zhì)上影響生物體的健康。卵子在受精后變化顯著，主要包括卵膜硬化，這個(gè)過程復(fù)雜并且涉及了細(xì)胞和分子方面的變化。本文重點(diǎn)介紹了硬骨魚魚卵卵膜硬化的機(jī)理。我們認(rèn)為，卵膜硬化可能分兩個(gè)步驟進(jìn)行：(a)金屬蛋白酶(alveolin)水解透明帶蛋白ZP1的N端脯氨酸-谷氨酰胺(Pro-Gln)區(qū)域，(b)谷氨酰胺轉(zhuǎn)移酶(TGase)催化水解的ZP1與ZP3發(fā)生分子交聯(lián)。在不同的物種中，受精后卵膜的硬化具有進(jìn)化保守性。我們探討并總結(jié)了在哺乳動(dòng)物和非哺乳動(dòng)物卵子卵膜硬化過程中涉及與生化功能和分子間相互作用相關(guān)的重要因子：包括金屬蛋白酶、 TGase、過氧化物酶和其他因素(多糖鏈、Zinc和Larp6蛋白)。相關(guān)數(shù)據(jù)表明，在體內(nèi)受精過程中，卵膜硬化對防止多精受精至關(guān)重要，同時(shí)在體外受精中，卵膜硬化有利于保護(hù)發(fā)育中的胚胎免受外界機(jī)械沖擊以及防止細(xì)菌感染。本文試圖通過進(jìn)一步闡釋受精過程卵膜硬化的機(jī)制，希望可以對生物繁殖和水產(chǎn)養(yǎng)殖有幫助。

受精是一個(gè)重要的生物學(xué)過程，在這個(gè)過程中，卵子變化顯著，其中最明顯的就是卵膜硬化。大多數(shù)脊椎動(dòng)物的卵被卵膜所包圍，這個(gè)結(jié)構(gòu)主要是母源糖蛋白組成的細(xì)胞外基質(zhì)（EMC）。不同的物種對卵或胚胎的卵膜結(jié)構(gòu)有不同的命名，例如在哺乳動(dòng)物中被稱為透明帶（zona pellucida, ZP）、在鳥類中被稱為卵周層（perivitelline layer）、在兩棲動(dòng)物中稱之為卵黃膜（vitelline envelope）以及在魚類中稱之為絨毛膜（chorion）。

根據(jù)先前的研究，在本文中統(tǒng)一用“卵膜（egg envelope）”一詞來描述與卵膜密切相關(guān)的糖蛋白ECM層。

受精后卵膜的變化對于生殖健康很重要，因?yàn)槭芫巧钠鹗?。在水生物種中，硬化的卵膜通過提供一種分散和附著的介質(zhì)來影響胚胎的發(fā)育，或者在胎生物種中，硬化的卵膜可保護(hù)發(fā)育中的胚胎直到孵化。

在許多物種中已報(bào)道了可能導(dǎo)致卵膜硬化的生化過程。在哺乳動(dòng)物中，卵膜硬化可能涉及四個(gè)生化過程：（a）ovastacin裂解ZP2；（b）ZP3和其他ZP亞基的去糖基化; （c）通過凝集素使聚糖交聯(lián)；（d）鋅離子與ZP結(jié)合。在無尾兩棲類的卵中，鋅金屬蛋白酶在ZP2的N末端結(jié)構(gòu)域的單個(gè)殘基處進(jìn)行水解，引起糖蛋白ZP的構(gòu)象變化，從而導(dǎo)致卵膜變硬。海膽卵膜的交聯(lián)機(jī)制也已有報(bào)道，主要包括谷氨酰胺轉(zhuǎn)移酶催化鄰近的谷氨酰胺和賴氨酸發(fā)生交聯(lián)，以及過氧化物酶介導(dǎo)的交聯(lián)，這些過程導(dǎo)致受精后卵膜變化顯著。

此外，已有研究表明雙翅目昆蟲的卵膜在過氧化酶的催化下介導(dǎo)雙酪氨酸或三酪氨酸形成交聯(lián)。雖然關(guān)于魚類硬化酶的相關(guān)研究在早期已有總結(jié)，但魚類卵膜硬化機(jī)制仍然是受精生物學(xué)中的一個(gè)有趣的問題。在硬骨魚類受精過程中，魚卵卵膜和卵表面發(fā)生了顯著的生理變化。這些轉(zhuǎn)變包括與卵膜硬化相關(guān)的細(xì)胞和分子方面的變化：柔軟、易碎的卵包膜變?yōu)閳?jiān)韌的結(jié)構(gòu)，從而保護(hù)發(fā)育中的胚胎免受水生環(huán)境危害和病原體的侵害。在硬化的過程受到多種酶的調(diào)控，這些酶在復(fù)雜的硬化過程中起關(guān)鍵作用。本文關(guān)注并綜述了近年來魚類卵膜硬化的細(xì)胞和分子機(jī)制的研究進(jìn)展，以加深和拓寬我們對卵膜的認(rèn)識。

在不同的物種中，受精后卵膜的硬化具有進(jìn)化保守性，如硬骨魚、無尾目（蛙)、雙翅目動(dòng)物等非哺乳類物種，以及小鼠、倉鼠、豬等哺乳類物種。在不同的物種中，這一課題的研究已經(jīng)取得了比較廣泛的進(jìn)展。本文綜述了近年來有關(guān)哺乳動(dòng)物和非哺乳動(dòng)物中卵膜硬化相關(guān)影響因素的生化功能和相互作用，包括酶（金屬蛋白酶、谷氨酰胺轉(zhuǎn)移酶、過氧化物酶/卵過氧化物酶）和其他因素(多糖物質(zhì)、鋅和Larp6蛋白)，表明卵膜硬化的過程涉及導(dǎo)致細(xì)胞和分子組成變化的復(fù)雜反應(yīng)。卵膜硬化是受精和繁殖的重要步驟。了解介導(dǎo)受精的細(xì)胞和分子機(jī)制將有助于解決人類特發(fā)性原因引起的不育或有助于應(yīng)用在實(shí)際生產(chǎn)的養(yǎng)殖業(yè)中。

01卵膜

在早期生命階段，卵膜是一種必要的結(jié)構(gòu)，在多物種間表現(xiàn)出功能多樣性，對生物體生殖健康有重要影響。哺乳動(dòng)物體內(nèi)受精后，卵膜發(fā)生硬化對防止多精受精具有重要作用。在體外受精的硬骨魚類中，卵受精后的硬化過程中卵膜發(fā)生顯著變化，這有利于：(1)保持水分或壓力；(2)在水環(huán)境中保護(hù)胚胎；(3)絨毛膜的氣體擴(kuò)散與交換；(4)硬化；(5)阻擋細(xì)菌和真菌。在體外發(fā)育的生物體中，如大多數(shù)魚類、海膽和無尾目(蛙類)，胚胎的發(fā)育環(huán)境危險(xiǎn)，其卵膜通常比在體內(nèi)發(fā)育的胚胎的卵膜需要更多的功能。

卵膜在物種間表現(xiàn)出顯著的結(jié)構(gòu)多樣性。透射電子顯微鏡(TEM)觀察到的不同物種卵膜超微結(jié)構(gòu)不同，通常由2-3層構(gòu)成 (圖1)。鳥類的卵膜包含2層，由一層連續(xù)的薄膜分隔開, 卵膜內(nèi)層或卵黃周層由1- 3.5μm厚的纖維網(wǎng)絡(luò)組成，介導(dǎo)了物種間特異性的精子結(jié)合，而外層的厚度有3-8μm，被認(rèn)為與受精后防止多精入卵有關(guān)。魚類卵膜包含2 -3層，內(nèi)層為纖維結(jié)構(gòu)，而外層無定形結(jié)構(gòu)，此外，粘性卵受精或激活后外部可能出現(xiàn)粘性層。蠅(雙翅目)的卵膜由2層組成：內(nèi)卵黃層和外絨毛膜層，對防止脫水、阻隔多精受精和抵抗機(jī)械壓力具有重要作用。兩棲類新產(chǎn)出的卵母細(xì)胞被體腔膜包圍，體腔膜由相互連接的束狀結(jié)構(gòu)構(gòu)成，這種結(jié)構(gòu)通過跨越卵周隙的密集纖維網(wǎng)絡(luò)與質(zhì)膜的微絨毛突出物相連，不具有精子結(jié)合活性。

 圖1.代表性生物卵膜的透射電鏡和掃描電鏡（TEM和SEM)超微結(jié)構(gòu)分析。(A)哺乳動(dòng)物卵膜(EE;大鼠,TEM)。(B)昆蟲卵膜(En: 絨毛膜內(nèi)層；Ex:絨毛膜表層；p:柱狀物；埃及伊蚊（Aedes aegypti mosquitoes），TEM, 430 x)。(C)兩棲動(dòng)物體腔卵膜(EE；非洲爪蛙（Xenopus laevis）TEM)。(D)鳥類卵膜(OL:外層；CM:連續(xù)膜；IL：內(nèi)層；環(huán)頸雉(Phasianus colchicus, TEM)。(E)魚類卵膜(EE， CA:皮層小泡；斑馬魚(Danio rerio)，TEM)。(F)魚卵膜(EE；卵孔 (箭頭)；鯉魚(Cyprinus carpio, SEM)。

02ZP蛋白

卵膜由纖維基質(zhì)組成，成分保守，含有共同的ZP結(jié)構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)域在哺乳動(dòng)物、兩棲動(dòng)物、鳥類和魚類中結(jié)構(gòu)各有不同。然而一直以來ZP糖蛋白家族的分類較為混亂，最近通過基因復(fù)制和假基因化形成了對ZP家族分類的共識：包括了六個(gè)亞家族， 分別是ZP1, ZP2/ZPA,ZP3/ZPC,ZP4/ZPB, ZPAX, ZPD 。在哺乳動(dòng)物和其他脊椎動(dòng)物中發(fā)現(xiàn)ZP1-4。小鼠中的ZP4和狗、豬、貓、牛中的ZP1為假基因。ZPD和ZPAX在所有哺乳動(dòng)物中均已假基因化或丟失。ZPD只在兩棲動(dòng)物和鳥類中存在，而ZPAX只在魚類、兩棲動(dòng)物和鳥類中存在。事實(shí)上，所有哺乳動(dòng)物的卵膜都含有ZP2和ZP3蛋白，以及ZP1和ZP4蛋白中的一種或兩種。這些發(fā)現(xiàn)可能意味著哺乳動(dòng)物精卵相互作用需要ZP2、ZP3以及ZP1和ZP4中的一個(gè)或兩個(gè)的存在。ZP2和ZP3亞家族在脊椎動(dòng)物譜系中的普遍存在表明這兩個(gè)基因在功能上都很重要。在脊椎動(dòng)物中，ZP基因的數(shù)量與卵受精和胚胎發(fā)育的環(huán)境有關(guān)。哺乳動(dòng)物的一些ZP基因丟失可能是因?yàn)樗鼈冊诨|(zhì)形成和精卵相互作用中沒有發(fā)揮重要作用。

不同物種的ZP蛋白合成位點(diǎn)不同。在哺乳動(dòng)物和兩棲類中，ZP蛋白僅由卵母細(xì)胞和/或?yàn)V泡細(xì)胞在卵巢中合成，而在魚類和鳥類中，ZP蛋白在雌激素的作用下在卵巢和/或肝臟中合成，并通過血液運(yùn)輸?shù)铰殉玻⒃诼炎又車晕医M裝。在哺乳動(dòng)物中，糖蛋白持續(xù)在卵母細(xì)胞膜的外表面沉積，直到斑塊間相互連接。同時(shí)ZP蛋白前體合成，糖基化修飾，分泌并結(jié)合形成具有結(jié)構(gòu)重復(fù)的交聯(lián)絲。早期的ZP糖蛋白被并入到與卵母細(xì)胞質(zhì)膜(PM)融合的分泌囊泡中，并沉積到不斷增厚的卵膜的最內(nèi)層。在大多數(shù)硬骨魚中，可溶性ZP蛋白前體由肝細(xì)胞分泌，通過血液運(yùn)輸?shù)铰涯讣?xì)胞，合并到卵膜。ZP前體在卵周隙累積，位于從卵母細(xì)胞的質(zhì)膜延伸到濾泡細(xì)胞的長微絨毛基部。當(dāng)卵母細(xì)胞積累卵黃時(shí)，卵膜組裝進(jìn)行，螺旋狀糖蛋白束形成放射狀結(jié)構(gòu)，然后被延伸的微絨毛分開。

ZP結(jié)構(gòu)域是由一個(gè)N端亞結(jié)構(gòu)域(ZP- N)和一個(gè)C端亞結(jié)構(gòu)域(ZP-C)組成的保守模塊，具有類似免疫球蛋白(Ig)的折疊，可能有雙重功能。生化數(shù)據(jù)表明，蛋白質(zhì)聚合只需要ZP- N，從而將ZP蛋白轉(zhuǎn)化為更高級的結(jié)構(gòu)如原纖維和基質(zhì)。在硬骨魚中，卵發(fā)生皮層反應(yīng)并分泌TGase，TGase可能誘導(dǎo)在卵膜富含脯氨酸/谷氨酰胺(Pro/Gln)重復(fù)區(qū)域的亞基之間交聯(lián)使卵膜硬化。透射電鏡觀察斑馬魚卵膜為三層，其中內(nèi)層的厚度占據(jù)75-80%，主要是由ZP3蛋白組裝而成。除了含有ZP結(jié)構(gòu)域外，zfZP3還表現(xiàn)出一些獨(dú)特的特征：包括可能與受精后卵膜硬化有關(guān)的富含5個(gè)谷氨酰胺串聯(lián)重復(fù)序列的N末端，還有含有兩個(gè)N -連接型糖基化位點(diǎn)的長C端尾巴。在魚類中，兩個(gè)或兩個(gè)以上的ZP1同源物的存在預(yù)示著卵膜上存在更多的交聯(lián)，這與魚類卵膜所表現(xiàn)的對機(jī)械化學(xué)脅迫的抗性一致。鯉魚ZP1(最初稱為ZP2)由一個(gè)串聯(lián)重復(fù)結(jié)構(gòu)域和一個(gè)非重復(fù)結(jié)構(gòu)域組成，重復(fù)序列包含13個(gè)氨基酸殘基，具有高含量的谷氨酰胺。此外，ZP1和其他鯉魚卵膜物質(zhì)（FLS、CLS和cystatin)可能是TGase的底物。和浮性卵相比，沉性卵具有結(jié)構(gòu)更復(fù)雜、更厚的卵膜，從而保護(hù)作用更強(qiáng)，這表明ZP蛋白結(jié)構(gòu)和卵的類型可能影響卵膜的厚度。ZP的組成結(jié)構(gòu)和類型與卵膜硬化密切相關(guān)。

03硬骨魚卵膜的硬化

與哺乳動(dòng)物相比，硬骨魚的精子不具有頂體，精子只能通過卵子上的一個(gè)特殊的漏斗狀結(jié)構(gòu)即微孔，進(jìn)入卵子。精子進(jìn)入魚卵的方式和機(jī)制已有很多研究，精子通過微孔進(jìn)入卵子是根據(jù)物種的不同在化學(xué)或物理上被引導(dǎo)的。受精后，硬骨魚魚卵卵發(fā)生皮層反應(yīng)，皮質(zhì)小泡的內(nèi)容物被釋放到卵表面，導(dǎo)致卵孔被堵塞(圖1)和卵膜蛋白重組，從而形成受精膜。本文主要關(guān)注卵膜硬化的作用—這也是受精過程中最重要的方面之一。

在受精過程中，卵膜發(fā)生了持續(xù)性的化學(xué)和物理結(jié)構(gòu)的變化，使卵膜變得堅(jiān)韌并能抵抗機(jī)械、化學(xué)和酶的破壞。據(jù)報(bào)道,一些魚類的受精卵(如褐鱒(Salmo trutta),大西洋鮭魚(Salmo salar)和虹鱒（Oncorhynchus mykiss)，和未受精卵相比，能抵抗更多的外界壓力(受精后3-7天的褐鱒和大西洋鮭魚受精卵能抵擋的壓力是未受精魚卵的10-20倍，受精后24 h的虹鱒魚卵能抵抗的壓力是未受精魚卵100倍左右)。卵膜的修飾在防止多精受精、保護(hù)發(fā)育中的胚胎免受機(jī)械沖擊以及保護(hù)卵子免受細(xì)菌感染等方面發(fā)揮著重要作用。此外，許多淡水魚類，尤其是鯉科魚類，魚卵在受精幾秒鐘后具有粘性，使卵與卵之間、卵與水生植物、石頭等基質(zhì)粘附在一起。卵的粘性在30秒內(nèi)完全形成，至少持續(xù)5分鐘，這是由皮層小泡釋放的通過卵膜擴(kuò)散到卵表面的物質(zhì)介導(dǎo)和控制。然而，鯉科魚類的卵膜硬化的過程要慢得多，持續(xù)時(shí)間約為1小時(shí)，這表明從皮層小泡釋放的的某些物質(zhì)(糖蛋白)可能參與了卵膜硬化和卵的粘性。

魚類卵膜硬化是由皮層小泡釋放的某些物質(zhì)引起的。有報(bào)道稱，卵膜的組成蛋白在硬化過程中發(fā)生聚合，并且TGase可能參與了這種聚合。TGase在整個(gè)生物系統(tǒng)發(fā)育過程中被發(fā)現(xiàn)，并通過形成ε（γ-谷氨?；┵嚢彼徭I使蛋白質(zhì)交聯(lián)。這些共價(jià)鍵通常是不可逆的，并受底物有效性、核苷酸和/或鈣離子的調(diào)節(jié)。已證明在多種魚類卵膜中發(fā)現(xiàn)TGase，如虹鱒、青鳉[82]和鯉魚。然而，卵膜中TGase直到發(fā)生皮層反應(yīng)時(shí)才具有酶活性。這意味著在皮層反應(yīng)過程中，可能從卵中釋放出來的某些物質(zhì)與TGase活性有關(guān)。此外，對青鳉卵膜硬化過程的研究表明，alveolin水解ZP蛋白，引起其與zp3在谷氨酰胺轉(zhuǎn)移酶的作用下發(fā)生分子間交聯(lián)。Alveolin轉(zhuǎn)錄本與皮質(zhì)肺泡成分相關(guān)。Alveolin是astacin金屬蛋白酶家族成員之一，在卵母細(xì)胞中特異性表達(dá)。受精后，經(jīng)過絲氨酸蛋白酶處理后，alveolin以活性形式釋放出來，在位于Pro-Gln -X重復(fù)區(qū)域的天冬氨酸殘基的N端處裂解ZP1，引起卵膜硬化。在ZP蛋白的N端存在Pro-Gln-X重復(fù)區(qū)是許多硬骨魚類ZP1的一個(gè)特殊特征，有時(shí)在ZP3中也可以觀察到同樣的現(xiàn)象。富含Q串聯(lián)重復(fù)序列的ZP蛋白[58,60,86]和具有賴氨酸高含量的cystatin (111個(gè)氨基酸中有13個(gè)賴氨酸)。因此，這些物質(zhì)可能是TGase的底物，能夠被催化形成γ-谷氨?；?ε-賴氨酸交聯(lián)鍵，最終促進(jìn)卵膜硬化。

因此，魚類卵膜硬化的發(fā)生可能分為兩個(gè)步驟: (a)由皮質(zhì)小泡釋放的金屬蛋白酶alveolin水解ZP1的N端Pro-Gln區(qū)域; (b)在TGase催化下，ZP蛋白（ZP1和ZP3）形成γ-谷氨酰胺-賴氨酸(γ-Gln-ε- lys)交聯(lián)(圖2)。

 圖2.魚卵基本結(jié)構(gòu)示意圖(A)以及魚類卵膜硬化可能涉及的生化過程(B)。魚卵包膜硬化可分兩步進(jìn)行。受精后，pro-alveolin和未激活的TGase被加工成活性形式并釋放到卵周隙。(a) alveolin水解ZP1 N端的Pro-Gln區(qū)域，(b) 在TGase催化誘導(dǎo)下與ZP3的分子間交聯(lián)，形成γ-Gln-ε-Lys異肽橋。EE：卵膜；PM：質(zhì)膜；PVS：卵周隙；CA:皮層小泡；Yg：卵黃顆粒；Gln:谷氨?；籐ys:賴氨酸。 

04與卵膜硬化相關(guān)的生化和分子因素

受精是后生動(dòng)物繁殖的必要條件，受精后卵膜硬化是在進(jìn)化過程中具有保守性。卵膜的分子組成、結(jié)構(gòu)和功能在不同物種中表現(xiàn)出多樣性。卵膜硬化在幾十年前就被描述過，硬化現(xiàn)象中發(fā)生的生化修飾也在多個(gè)物種中研究過。越來越清楚的是，卵膜蛋白在受精硬化中的變化與多種酶催化的復(fù)雜的反應(yīng)相關(guān),這些酶包括可限制性水解卵膜的金屬蛋白酶以及催化的蛋白交聯(lián)聚合的TGase或過氧化物酶/ ovoperoxidase。這個(gè)過程還受到其他因素的影響,包括多糖鏈、zinc和Larp6蛋白。以下章節(jié)和表1總結(jié)了與卵膜硬化相關(guān)的生化和分子因素。

4.1金屬蛋白酶

皮層小泡釋放的金屬蛋白酶可以消化一些卵膜蛋白，消化的卵膜蛋白是TGase有效利用的底物，從而導(dǎo)致許多物種的卵膜硬化，這些物種包括青鳉、非洲爪蟾和小鼠。此外，alveolin是astacin金屬蛋白酶家族成員之一，在卵子發(fā)生過程中合成，并在青鳉魚卵卵母細(xì)胞中特異性表達(dá)。Alveolin以糖基化的潛在前體形式包裝在皮質(zhì)顆粒中，受精時(shí)通過絲氨酸蛋白酶去除前域而被激活，然后釋放。Alveolin 水解ZP1，導(dǎo)致卵膜蛋白重組，在TGase催化作用下ZP蛋白質(zhì)發(fā)橫交聯(lián)反應(yīng)(圖3A)。此外，在硬骨魚、兩棲類和鳥類等一些物種中，astacin樣蛋白酶發(fā)揮孵化酶功能。在青鳉中，孵化酶(HCE1, HCE2和LCE)水解卵膜蛋白，魚卵孵化，而alveolin引起卵膜蛋白的重組，導(dǎo)致受精時(shí)卵膜變硬。Astacin家族的系統(tǒng)發(fā)育分析表明脊椎動(dòng)物astacin家族成員中alveolin的獨(dú)特性: 它在系統(tǒng)發(fā)育上與孵化酶類群分離，這可能反映了兩者之間結(jié)構(gòu)和底物特異性的差異。

雖然根據(jù)系統(tǒng)發(fā)育分析，ovastacin被認(rèn)為是哺乳動(dòng)物中魚類孵化酶的同源物。研究發(fā)現(xiàn)，受精發(fā)生時(shí)儲(chǔ)存在皮層小泡中的ovastacin釋放，然后裂解ZP2。ovastacin由基因Astl編碼。Alveolin并不是ovastacin的直接同源物，但alveolin和ovastacin在其表達(dá)模式和生物學(xué)功能上具有相似性(Fig.3A)。在小鼠中，ovastacin的C端結(jié)構(gòu)域仍有一部分附著在質(zhì)膜上，而ovastacin N端活躍的結(jié)構(gòu)域則被暴露出來，破壞ZP精子配體，引發(fā)卵膜硬化。除了在ZP2的裂解中發(fā)揮作用外，ovastacin是一種卵母細(xì)胞特異性膜金屬蛋白酶，稱之為SAS1B，它通過結(jié)合分泌蛋白介導(dǎo)ZP2裂解并在小鼠受精時(shí)ovastacin前體的激活過程中發(fā)揮重要作用。

卵膜硬化的機(jī)制包括以卵子鋅金屬蛋白酶限制性水解ZP2蛋白為誘發(fā)事件，隨后誘導(dǎo)卵膜糖蛋白的整體構(gòu)象變化。有研究表明只有一小部分的ZP2分子被水解。當(dāng)大約16%的ZP2被水解時(shí)，可以觀察到哺乳動(dòng)物的卵膜完全硬化。水解和硬化的研究表明二者的反應(yīng)時(shí)間不一致：硬化反應(yīng)發(fā)生水解反應(yīng)之前。這可能表明，在受精過程中還有其他因素的參與，而且水解和硬化是由多種酶催化的復(fù)雜的過程。

4.2谷氨酰胺轉(zhuǎn)移酶（TGase）

TGase也被稱為蛋白質(zhì)谷氨酰胺γ谷氨酰胺轉(zhuǎn)移酶，是一種依賴于鈣離子的多功能酶，催化谷氨酸殘基的γ羧基和賴氨酸的ε氨基之間形成不可逆的共價(jià)鍵。TG家族由8種同工酶組成，在脊椎動(dòng)物的不同組織中表達(dá)，參與凝血、凋亡、皮膚形成和轉(zhuǎn)錄調(diào)控等過程。TG1缺陷小鼠出生后立即死亡，原因是表皮異常，屏障功能不足，而TG1同源敲除的青鳉突變體存活并發(fā)育，沒有任何異常。但是在NaCl水溶液中飼養(yǎng)的青鳉突變體幼魚的存活時(shí)間卻短于野生型，說明其表皮發(fā)育不足，幼魚無法適應(yīng)滲透的變化，最終無法生存。

TGase對在一些魚類的卵膜硬化過程中的蛋白質(zhì)聚合有重要作用，可能在卵膜富含Pro/Gln的重復(fù)區(qū)域的亞基之間誘導(dǎo)交聯(lián)。ZP1含有獨(dú)特的串聯(lián)重復(fù)序列QQTSQQFQPQKPA/V ，ZP3也表現(xiàn)出高含量的谷氨酰胺殘基，而cystatin則表現(xiàn)出高含量的賴氨酸。因此，這些物質(zhì)可能是TGase的底物，并可催化形成γ-谷?；?ε-賴氨酸交聯(lián)，最終導(dǎo)致卵膜硬化(圖3B)。值得注意的是，魚卵ZP1蛋白具有獨(dú)特的結(jié)構(gòu)域，但不像哺乳動(dòng)物的ZP1和ZP4,它們具有豐富的谷氨酰胺(Q)和/或脯氨酸(P)并可作為N端延伸。魚類與哺乳動(dòng)物ZP結(jié)構(gòu)的差異可能與體外受精向體內(nèi)受精的轉(zhuǎn)變有關(guān)。

海膽卵子具有兩種TGases，其中胞外亞型(eTG)是導(dǎo)致受精膜(FE)蛋白交聯(lián)的主要亞型。這種酶的激活似乎是由于酸從細(xì)胞皮層釋放到卵細(xì)胞表面引起的pH值的快速改變。也許pH值的變化改變了eTG的構(gòu)象以暴露酶的位點(diǎn)。另外，TGase與其他蛋白的結(jié)合可能會(huì)因pH的變化而改變。此外，TGase可以調(diào)節(jié)海膽ECM重塑過程中其他酶的活性。TGase被局部酸化激活，并在受精膜中作用于特定的底物包括ovoperoxidase、rendezvin和SFE9，以及通過直接接合過氧化物酶和調(diào)節(jié)過氧化氫的產(chǎn)生來調(diào)節(jié)二酪氨酸交聯(lián)。

此外，ECM由各種不同的分子組成，包括膠原蛋白、纖維連接蛋白和層粘連蛋白。纖維連接蛋白、膠原蛋白、肌動(dòng)蛋白和肌球蛋白也是TGase的底物。纖維連接蛋白與膠原蛋白或整合素以及微絲相關(guān)蛋白相互作用，并進(jìn)一步通過調(diào)節(jié)表面tTG招募蛋白酶抑制劑(如cystatin)，這對于細(xì)胞基質(zhì)的相互作用和穩(wěn)定性以及細(xì)胞粘附是必不可少的。因此，這些物質(zhì)可能是TGase的底物，TGase在它們之間催化形成γ-谷氨?；?ε-賴氨酸交聯(lián)。

4.3過氧化物酶/Ovoperoxidase

過氧化物酶存在于大多數(shù)物種中，通過生物體內(nèi)蛋白質(zhì)的交聯(lián)參與組織發(fā)生，包括海膽、節(jié)肢動(dòng)物，所產(chǎn)生的結(jié)構(gòu)是卵膜組織的必要結(jié)構(gòu)元素。早在1978年，就有過氧化物酶催化酪氨酸交聯(lián)導(dǎo)致海膽卵膜硬化的報(bào)道。進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)過氧化物酶是一種皮層顆粒衍生酶，通過催化酪氨酸殘基的形成使海膽受精膜硬化(圖3C)。

然而，在動(dòng)物中受精膜的硬化不會(huì)作為單一事件發(fā)生。Ovoperoxidase與蛋白水解酶協(xié)同作用，催化海膽中雙酪氨酸殘基的形成，或利用海膽胚胎產(chǎn)生的過氧化氫(H2O2)交聯(lián)受精膜蛋白中的酪氨酸殘基。此外，在埃及伊蚊中，過氧化物酶可還原H2O2(作為電子受體)，同時(shí)伴有多種底物的一電子和/或兩電子氧化，如有機(jī)底物、酪氨酸或蛋白質(zhì)中的酪氨酸殘基。H2O2在海膽卵中由海膽雙氧化酶1 (Udx1)合成。Udx1是雙氧化酶家族的一員，其名稱來源于過氧化物酶域和NAD(P)H氧化酶域(一種鐵還原酶)。NAD(P)H氧化酶結(jié)構(gòu)域利用來自輔酶NADPH的電子氧化水產(chǎn)生H2O2，也會(huì)隨著NO的增加而上調(diào)，并增強(qiáng)海膽受精膜硬化。這種酶只有在卵子激活后，即皮質(zhì)顆粒分泌接近完成時(shí)才會(huì)啟動(dòng)。在這一階段，過氧化物酶和需要交聯(lián)來穩(wěn)定的蛋白質(zhì)，都在離質(zhì)膜（PM）很遠(yuǎn)的地方，即正在組裝但未成熟的受精膜內(nèi)。受精時(shí)產(chǎn)生的H2O2主要被過氧化物酶/過氧化物酶利用，選擇性地在動(dòng)物中相鄰蛋白和ECM之間建立二酪氨酸交聯(lián)。

此外，海膽ECM重塑過程中過氧化物酶的活性可能受到TGase的調(diào)節(jié)。TGase被局部酸化激活，作用于受精膜內(nèi)的過氧化物酶。過氧化物酶和H2O2的結(jié)合最終調(diào)節(jié)了雙酪氨酸交聯(lián)，這可能表明在卵膜蛋白聚合導(dǎo)致的卵膜硬化過程中，TGase和過氧化物酶/ ovoperoxidase的密切合作發(fā)揮了重要作用。

圖3.卵膜硬化過程中三種主要酶的生化功能及其相互作用。(A)金屬蛋白酶(ovastacin/alveolin)的裂解。絲氨酸蛋白酶激活pro-ovastacin(在哺乳動(dòng)物中)或pro-alveolin(在青鳉中)，誘導(dǎo)ZP蛋白特異性位點(diǎn)裂解，即水解ZP蛋白N端的Pro-Gln - x重復(fù)區(qū)，并在谷氨酰胺轉(zhuǎn)移酶的催化誘導(dǎo)下與另一個(gè)ZP蛋白發(fā)生分子間交聯(lián)。在ZP的N端陰影區(qū)是一個(gè)重復(fù)區(qū)域。(B) γ-谷氨酰基-ε-賴氨酸(γ-Gln- ε-Lys)交聯(lián)的形成。TGase催化蛋白質(zhì)交聯(lián)，在一個(gè)蛋白質(zhì)的去質(zhì)子賴氨酸(Lys)供體殘基(藍(lán)色方塊)和另一個(gè)蛋白質(zhì)的受體谷氨酰胺(Gln)殘基(綠色方塊)之間形成γ-Gln-ε-Lys異肽橋。(C)酪氨酸交聯(lián)的形成。過氧化物酶/ovoperoxidase以過氧化氫(H2O2)作為電子受體，催化酪氨酸或蛋白質(zhì)(橙色方塊)中的酪氨酸的單電子氧化，導(dǎo)致酪氨酸自由基的形成，酪氨酸自由基的相互作用導(dǎo)致雙酪氨酸的形成。 

4.4其他與卵膜硬化有關(guān)的因素

其他與受精時(shí)卵膜硬化有關(guān)的生化因素，主要在哺乳動(dòng)物中進(jìn)行了研究，包括寡糖鏈和鋅離子與ZP的結(jié)合。ZP對蛋白質(zhì)水解的易感性可通過作用于其可變的多糖部分而改變，這表明ZP蛋白寡糖鏈的改變可能參與了小鼠ZP的硬化。此外，最近的研究報(bào)道了zinc sparks在ZP硬化防止多精入卵的過程中發(fā)揮全新功能。受精卵釋放的zinc sparks通過改變ZP復(fù)合物的構(gòu)象，在小鼠ZP硬化過程中加入之前未被認(rèn)識的鋅因子，從而導(dǎo)致多精受精。Zinc sparks可以通過改變ZP1的交聯(lián)構(gòu)像改變ZP的架構(gòu)。Zinc在調(diào)節(jié)肌動(dòng)蛋白細(xì)絲中的新作用是可能調(diào)節(jié)卵母細(xì)胞成熟和胚胎著床，這可能影響精子和卵子之間的相互作用。因此，zinc的外排是另一個(gè)有助于ZP硬化的因素。然而，目前尚不清楚zinc sparks對ZP聚合的影響是由于與基質(zhì)的非特異性相互作用導(dǎo)致的，還是由一個(gè)或多個(gè)ZP亞基內(nèi)的特定結(jié)合位點(diǎn)介導(dǎo)所導(dǎo)致的。

此外，最近的一項(xiàng)研究表明，Larp6蛋白是正常卵母細(xì)胞發(fā)育、卵膜形成和卵激活所必需的蛋白。Larp6是La相關(guān)蛋白(Larps)家族的成員，是進(jìn)化保守的RNA結(jié)合蛋白，在真核生物中發(fā)揮多種功能。斑馬魚有兩個(gè)larp基因，larp6α和larp6β基因。Larp6a突變的雌魚產(chǎn)的魚卵卵膜不能完全擴(kuò)張，而且易破。larp6α、larp6β雙突變的雌魚產(chǎn)的魚卵卵膜比larp6α單突變的缺陷更大。此外，在卵母細(xì)胞發(fā)育過程中對缺陷卵膜的電子顯微鏡分析和質(zhì)譜分析提供了對卵膜蛋白組成的描述，發(fā)現(xiàn)與野生型相比，ZP和凝集素型蛋白顯著減少，這與表型的缺陷相一致。在Larp6缺失的胚胎中，缺乏擴(kuò)張的卵膜可能會(huì)大大降低胚胎在野外的存活率。

表1.與卵膜硬化相關(guān)的主要生化和分子因素

05總結(jié)與展望

受精是后生動(dòng)物繁殖的必要過程。受精后卵膜的變化對生殖健康非常重要，因?yàn)樗鼈兘閷?dǎo)了生命的開始。在這篇綜述中，我們主要關(guān)注與卵膜變化相關(guān)的分子和細(xì)胞事件。越來越清楚地認(rèn)識到，卵膜硬化是一個(gè)復(fù)雜的現(xiàn)象，包括多個(gè)過程，涉及多種酶，它們可以獨(dú)立地、平行地發(fā)生，也可以相互關(guān)聯(lián)。在硬骨魚中，魚卵卵膜硬化過程中卵膜蛋白發(fā)生變化，是由多種酶催化的復(fù)雜反應(yīng)引起的。金屬蛋白酶啟動(dòng)了皮層反應(yīng)，對卵膜蛋白進(jìn)行限制性酶解，TGase通過誘導(dǎo)蛋白質(zhì)之間交聯(lián)使卵膜硬化，這個(gè)過程很可能是通過富含Pro/ Gln的重復(fù)區(qū)域。因此，我們認(rèn)為魚卵膜硬化可以分兩步進(jìn)行。受精后，pro-alveolin和未激活的TGase被加工成活性形式并釋放到卵周隙。(a)金屬蛋白酶(alveolin)水解ZP1的N端Pro-Gln區(qū)域，(b)在TGase催化作用下，與ZP3發(fā)生分子間交聯(lián)，形成γ-Gln-ε- Lys異肽橋。卵膜蛋白交聯(lián)導(dǎo)致卵膜硬化，可增加抵抗蛋白水解。目前的研究主要集中在實(shí)驗(yàn)室模型物種，例如青鳉和斑馬魚。在更廣泛的動(dòng)物類群中(如具有重要商業(yè)價(jià)值的物種)，解決與受精有關(guān)的細(xì)胞和分子事件也至關(guān)重要。增加對硬骨魚受精過程的了解可能會(huì)對水產(chǎn)養(yǎng)殖有所幫助。

受精后卵膜硬化在物種間表現(xiàn)出保守性。盡管卵膜具有基本的保守結(jié)構(gòu)，但動(dòng)物卵膜的進(jìn)化是高度動(dòng)態(tài)的。受精硬化過程中卵膜蛋白的轉(zhuǎn)變與生物化學(xué)因素影響的復(fù)雜反應(yīng)密切相關(guān)。我們探討并總結(jié)了在哺乳動(dòng)物和非哺乳動(dòng)物卵子卵膜硬化過程中涉及與生化功能和分子間相互作用相關(guān)的重要因子：包括金屬蛋白酶、 TGase、過氧化物酶/ ovoperoxidase，和其他因素(多糖鏈，Zinc和Larp6蛋白)。卵膜硬化阻止多精入卵在體內(nèi)受精是至關(guān)重要的，以及對保護(hù)發(fā)育中的胚胎免受機(jī)械沖擊和抵抗體外受精中的細(xì)菌感染也有重要作用，同時(shí)對進(jìn)一步的胚胎發(fā)育也有重要的影響。卵膜硬化不完全或過度硬化可能對魚類或其他物種的繁殖產(chǎn)生重大影響。加深對卵膜硬化和受精的了解后面可能更多依賴于轉(zhuǎn)錄組和蛋白質(zhì)組學(xué)的發(fā)展，同時(shí)強(qiáng)調(diào)進(jìn)一步的分子遺傳研究以獲得卵膜在進(jìn)化生物學(xué)的嚴(yán)謹(jǐn)認(rèn)知，這將有助于解決人類特發(fā)性原因的不孕或可以在實(shí)際生產(chǎn)中應(yīng)用于養(yǎng)殖業(yè)。

本文發(fā)表在Biochimie上（Wang YK, Chen F, He J, Xue G, Chen J, Xie P. 2021. Cellular and molecular modification of egg envelope hardening in fertilization. Biochimie 181: 134-144），第一作者是中國科學(xué)院水生生物研究所東湖湖泊生態(tài)系統(tǒng)試驗(yàn)站的王也可，通訊作者為謝平研究員，是中國科學(xué)院戰(zhàn)略性先導(dǎo)專項(xiàng)（B類）（XDB31040000）關(guān)于季風(fēng)氣候影響下東亞特有魚類卵型演化研究的一部分內(nèi)容。