魚病致病菌藥物敏感性的常用測定(下)：液體培養(yǎng)基稀釋法

抗菌藥物敏感性試驗（AST）簡稱藥敏試驗（或耐藥試驗），旨在了解病原菌對各種抗生素的敏感（或耐受）程度，以指導(dǎo)藥物治療中合理選用抗生素藥物的微生物學(xué)試驗。某種抗生素如果能以很小的劑量抑制、殺滅致病菌，則稱該種致病菌對該抗生素“敏感”。反之，則稱為“不敏感”或“耐藥”。為了解致病菌對哪種抗生素敏感，以合理用藥，減少盲目性，就應(yīng)該進(jìn)行對致病生物進(jìn)行藥敏試驗。

致病菌的藥敏試驗大致過程是：從患體的感染部位（病灶）采取含致病菌的標(biāo)本，接種在適當(dāng)?shù)?/span>培養(yǎng)基上，于一定條件下純化培養(yǎng)菌株。如果采用紙片瓊脂擴(kuò)散法（K-B法）完成藥敏試驗，就可將分別沾有一定量各種抗生素的紙片，貼在培養(yǎng)基表面或用不銹鋼圈，內(nèi)放定量抗生素溶液，培養(yǎng)一定時間后觀察抑、殺菌結(jié)果。由于致病菌對各種抗生素的敏感程度不同，在藥物紙片周圍便會出現(xiàn)不同大小的抑制致病菌生長而形成的“空圈”，稱為抑菌圈。抑菌圈大小與致病菌對各種抗生素的敏感程度成正比關(guān)系。因此，可以根據(jù)藥敏試驗結(jié)果有針對性地選用抗生素。

目前常用的藥敏試驗方法有：紙片瓊脂擴(kuò)散法（K-B法）、稀釋法、E試驗、檢測細(xì)菌耐藥性的方法。稀釋法又可分為液體稀釋法和瓊脂稀釋法。在人醫(yī)和獸醫(yī)方面，檢測細(xì)菌耐藥性的方法還包括耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（MRSA）的檢測、耐萬古霉素腸球菌（VER）的檢測、耐青霉素肺炎鏈球菌（PRP）的檢測、超廣譜β-內(nèi)酰胺酶（ESBL）的檢測和β-內(nèi)酰胺酶的檢測。

對于水生動物致病菌藥敏試驗主要采用紙片瓊脂擴(kuò)散法（K-B法）和稀釋法進(jìn)行。本文以稀釋法為例作簡要介紹，僅供參考。

接上期：魚病致病菌藥物敏感性的常用測定(上)：紙片瓊脂擴(kuò)散法

液體培養(yǎng)基稀釋法

液體培養(yǎng)基稀釋法適用于需氧及兼性厭氧的快速生長型致病菌，比如腸桿菌科、葡萄球菌屬和腸球菌屬；嗜血桿菌屬、奈瑟菌屬、肺炎鏈球菌及其他鏈球菌等菌株，還適用于厭氧菌、酵母樣真菌及支原體等。

根據(jù)每種藥物（根據(jù)藥物的性質(zhì)不同，按照表2的方法進(jìn)行稀釋）、致病菌種類和感染部位的不同，選擇不同的抗生素濃度稀釋范圍，用M-H肉湯以2n進(jìn)行倍比稀釋抗菌藥物（比如256、128、64、～0.125……）。

將稀釋后的藥物加入試管，或加入冷卻至45～55℃ M-H培養(yǎng)基中，立即在無菌條件下制作系列藥物濃度梯度的藥敏試驗試管（圖2）。

(圖2 試管內(nèi)藥敏試驗的試管內(nèi)藥物添加方法，仿日本化學(xué)療法學(xué)會，1975）

用無菌生理鹽水或M-H肉湯培養(yǎng)基，將菌液配置成106個/mL濃度的菌懸液。在配制好的含藥濃度梯度液體培養(yǎng)基試管中加入上述供試致病菌的菌懸液。制備好的藥物敏感測試試管放置于培養(yǎng)溫度為28℃條件下（注意根據(jù)致病菌的特性選擇培養(yǎng)適宜溫度），培養(yǎng)一定的時間后，再觀察試驗結(jié)果。

液體培養(yǎng)基稀釋法獲得的是供試藥物對致病菌的最小抑菌濃度（MIC）和最小殺菌濃度（MBC）。MIC的判讀即為肉眼觀察無致病菌生長試管中的最低藥物濃度，為該該供試藥物的MIC。MBC的判讀即為供試藥物殺滅99.9%或以上受試致病菌所需的最低濃度。具體做法是將高于MIC 1～3個稀釋度的試管中的培養(yǎng)液，轉(zhuǎn)接種于相應(yīng)的培養(yǎng)基平皿上，在28℃恒溫條件下培養(yǎng)18～24小時，與無致病菌生長的平皿對應(yīng)的藥敏試管中的藥物濃度，即判為殺滅99.9%或以上受試菌所需的MBC。

如果選用的抗菌素對某種致病菌沒有抑制作用，使用后就不可能獲得對疾病的治療效果。然而，即使某種抗菌素能抑制某種致病菌，不同的致病菌對同一種抗菌素的感受性也是存在差異的。因此，為了達(dá)到藥到病除或者獲得對疾病比較好的治療效果，篩選病原菌敏感的抗菌素作為治療養(yǎng)殖魚類疾病的藥物是很有必要的?，F(xiàn)在，研究者們采用在養(yǎng)殖現(xiàn)場分離到的養(yǎng)殖魚類致病菌進(jìn)行藥物敏感性試驗時，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)有些菌株對某些抗菌素失去了敏感性，或者感受性已經(jīng)下降了，這就是因為病原菌對這些抗生素產(chǎn)生了抗藥性。

病原菌對藥物的感受性一般都是采用最小抑菌濃度（MIC）表示。即每升（L）培養(yǎng)基中的抗菌藥物以毫克（mg）表示，作成倍比稀釋系列，當(dāng)接種在培養(yǎng)基中的病原菌被完全抑制的最低藥物濃度，即為表示藥物對致病菌菌株的最小抑菌濃度。

測定從患病養(yǎng)殖魚類中分離病原菌對各種抗菌藥物的敏感性，是保證藥物治療效果的關(guān)鍵。但是，開展這個工作要求有一定的試驗條件，而且要求操作者具備一定的專業(yè)知識和試驗技能，因此，尚不具備這種試驗條件的養(yǎng)殖單位和個人可以委托有條件的研究單位協(xié)助完成這項工作。

對水生動物致病菌的藥敏試驗結(jié)果，不僅可為科學(xué)地選擇治療藥物提供重要參考，避免漁用藥物的濫用或者誤用，而且通過監(jiān)控病原菌的耐藥性變遷，還可用于評價研制漁用藥物中新藥的抗菌譜和抗菌活性等藥效學(xué)特征。目前，在水生動物疾病防控中濫用抗生素的現(xiàn)象比較普遍，致使抗藥致病菌急劇增加，甚至因長期大量使用廣譜抗生素，大量殺傷了水生動物體內(nèi)正常微生物，失去微生物的相互制約作用，從而使一些少見的或一般情況下的非致病菌大量繁殖，引起所謂“二次感染”的情況屢有發(fā)生，給藥物治療水生動物感染性疾病造成人為的困難。因此，在水產(chǎn)養(yǎng)殖中提倡對水生動物致病菌進(jìn)行藥敏試驗，對于做到精準(zhǔn)用藥和堅持合理用藥是十分重要的。

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致謝作者：孟思妤，孟長明，陳昌福。
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