藥敏試驗常用方法——紙片擴散法、稀釋法和牛津杯法

藥敏試驗是一種防治魚病前預先在魚體外測定藥物抑菌或殺菌效能的試驗，用以作為選擇藥物與劑量參考。稍有水產(chǎn)養(yǎng)殖科研條件的單位經(jīng)常使用此種比較科學的測試方法，但很少在技術(shù)資料中看到。故筆者在此特作如下推薦和簡單介紹：

1.藥敏試驗的目的意義：

抗菌藥對細菌性傳染病的控制起到了非常重要的作用，但由于養(yǎng)殖過程中不科學地、盲目地濫用抗菌藥，很多致病性細菌產(chǎn)生了耐藥性，使得抗菌藥對細菌性疾病的控制效果越來越差，不但造成藥物浪費，而且還延誤病情，給養(yǎng)殖戶造成了很大的經(jīng)濟損失。

隨著新型致病菌的不斷出現(xiàn)，抗菌藥的防治效果越來越差。并且各種致病菌對不同的抗菌藥物的敏感性不同，同一細菌的不同菌株對不同抗菌藥物的敏感性也有差異。長期以來，各種致病菌耐藥性的產(chǎn)生使各種常用抗菌藥物往往失去藥效，以及不能很好地掌握藥物對細菌的敏感度，通過藥敏試驗可得到一個正確的結(jié)果，可作為養(yǎng)殖場選用抗菌藥物的參考，可提高療效。

2.藥敏試驗常用方法——紙片擴散法、稀釋法和牛津杯法

以下介紹常用于簡易定性測試的紙片擴散法。紙片擴散法是將含有定量抗菌藥物的濾紙片貼在已接種了測試菌的瓊脂表面上，紙片中的藥物在瓊脂中擴散，隨著擴散距離的增加，抗菌藥物的濃度呈對數(shù)減少，從而在紙片的周圍形成濃度梯度。同時，紙片周圍抑菌濃度范圍內(nèi)的菌株不能生長，而抑菌范圍外的菌株則可以生長，從而在紙片的周圍形成透明的抑菌圈，不同的抑菌藥物的抑菌圈直徑因受藥物在瓊脂中擴散速度的影響而可能不同，抑菌圈的大小可以反映測試菌對藥物的敏感程度，并與該藥物對測試菌的最小抑菌濃度（MIC）呈負相關(guān)。

①實驗材料準備

普通營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基∶可去生化試劑店購買，做不同細菌的藥敏試驗可選擇不同的培養(yǎng)基，如做大腸桿菌的藥敏試驗可選擇普通營養(yǎng)瓊脂或麥糠凱培養(yǎng)基；做沙門氏菌可選擇血清培養(yǎng)基。

藥敏片的準備：（購買或自制制備方法）取新華1號定性濾紙，用打孔機打成6mm直徑的圓形小紙片。取圓紙片50片放入清潔干燥的青霉素空瓶中，瓶口以單層牛皮紙包扎。經(jīng)15磅15～20分鐘高壓消毒后，放在37℃溫箱或烘箱中數(shù)天，使完全干燥。

抗菌藥紙片制作：在上述含有50片紙片的青霉素瓶內(nèi)加入藥液0.25mL，并翻動紙片，使各紙片充分浸透藥液，翻動紙片時不能將紙片搗爛。同時在瓶口上記錄藥物名稱，放37℃溫箱內(nèi)過夜，干燥后即密蓋，如有條件可真空干燥。切勿受潮，置陰暗干燥處存放，有效期3～6個月。

②儀器：接種環(huán)、酒精燈、移液器、滴頭

藥液的制備（用于商品藥的試驗）：按商品藥的使用治療量的比例配制藥液；此稀釋液即為用于做藥敏試驗的藥液。

藥敏片法：在“超凈臺”中，用經(jīng)（酒精燈）火焰滅菌的接種環(huán)挑取適量細菌培養(yǎng)物，以劃線方式將細菌涂布到平皿培養(yǎng)基上。具體方式：用滅菌接種環(huán)取適量細菌分別在平皿邊緣相對四點涂菌，以每點開始劃線涂菌至平皿的1/2。然后，找到第二點劃線至平皿的1/2，依次劃線，直至細菌均勻密布于平皿。（另：可挑取待試細菌于少量生理鹽水中制成細菌混懸液，用滅菌棉拭子將待檢細菌混懸液涂布于平皿培養(yǎng)基表面。要求涂布均勻致密，直接懸液法要把菌液濃度用生理鹽水或PBS調(diào)到0.5個麥氏標準再涂布均勻。）

將鑷子于酒精燈火焰滅菌后略停，取藥敏片貼到平皿培養(yǎng)基表面。為了使藥敏片與培養(yǎng)基緊密相貼，可用鑷子輕按幾下藥敏片。為了能準確地觀察結(jié)果，要求藥敏片能有規(guī)律的分布于平皿培養(yǎng)基上；一般可在平皿中央貼一片，外周可等距離貼若干片（外周一般可貼七片），每種藥敏片的名稱要記住。將平皿培養(yǎng)基置于37℃溫箱中培養(yǎng)24小時后，觀察效果。

③試驗結(jié)果觀察

在涂有細菌的瓊脂平板上，抗菌藥物在瓊脂內(nèi)向四周擴散，其濃度呈梯度遞減，因此在紙片周圍一定距離內(nèi)的細菌生長受到抑制。過夜培養(yǎng)后形成一個抑菌圈，抑菌圈越大，說明該菌對此藥敏感性越大，反之越小，若無抑菌圈，則說明該菌對此藥具有耐藥性。其直徑大小與藥物濃度、劃線細菌濃度有直接關(guān)系。

藥物敏感實驗判定標準：藥敏實驗結(jié)果，應按抑菌圈直徑大小作為判定敏感度高低的標準。

藥物敏感實驗判定標準參考表1，多黏菌素抑菌圈：在9mm以上為高敏，6～9mm為低敏，無抑菌圈為不敏。

表1 藥物敏感實驗判定標準表

④藥物敏感性影響因素

A、培養(yǎng)基

細菌藥敏試驗所用的培養(yǎng)基種類較多，多數(shù)情況下，采用WHO組織統(tǒng)一要求的M-H培養(yǎng)基，這種培養(yǎng)基中含有的低胸腺嘧啶是與磺胺類藥物競爭的物質(zhì)，因此進行的藥敏試驗效果較好。此外，還有適量的Ca、Mg，在培養(yǎng)基中起到觸媒的作用。但是，有些細菌對培養(yǎng)基中的成分有特殊的要求，特殊的菌要用特殊的培養(yǎng)基才能進行藥敏試驗。例如，流感嗜血桿菌的藥敏試驗培養(yǎng)基用HTM瓊脂；淋球菌的藥敏試驗培養(yǎng)基用加5%羊血的巧克力M-H瓊脂；肺炎鏈球菌的藥敏實驗用M-H瓊脂加5%的脫纖維羊血培養(yǎng)基。培養(yǎng)基中還有適量的Ca、Mg，在培養(yǎng)基中起到溶酶的作用，其含量的變化，可影響氨基糖苷類和四環(huán)素對銅綠假單胞菌的試驗結(jié)果，含量過高，抑菌圈會變小，含量過低，抑菌圈會大得不可接受。

細菌藥敏試驗的培養(yǎng)基厚度大約為4mm，若培養(yǎng)基厚度大于4mm，會使細菌出現(xiàn)耐藥;若小于4mm，本應耐藥的易出現(xiàn)敏感。所以，試驗時一定不要把藥敏紙片放在中央部位，而應均勻地排布在平皿周圍的培養(yǎng)基上。制作藥敏試驗的培養(yǎng)基用水，主要是Ca、Mg、A1等礦物質(zhì)離子，也在很大程度上影響著藥敏試驗的結(jié)果。

B、試紙片

試紙片材質(zhì)的好壞，對藥物穩(wěn)定性和活性有很大影響。加工藥敏試紙片的試紙一般是使用加厚型的濾紙，雜質(zhì)少，對藥物保存無太大影響。然而，臨床中很多用的是普通紙，被水浸潤后會呈堿性，并且含有大量無機離子，因此使用普通紙加工的試紙片藥物有較大的影響。藥敏紙片的pH值一般要求為中性，這樣才適合藥的活度。藥敏紙片的厚度要求大約1mm，這樣才有利于細菌的生長和藥物的擴散速度。藥敏紙片的直徑在6.00～6.35mm之間，紙片的厚度和直徑大小都會影響藥敏試驗的結(jié)果。

含藥紙片的片間差和質(zhì)量好壞是做藥敏試驗的關(guān)鍵。一些藥敏紙片買來時就有抑菌環(huán)偏大或偏小的問題，紙片之間又存在很大的片間差。因此，紙片在用前必須檢驗其片間差和準確度，只有都達到標準要求后才能使用。同時要注意紙片的保存，因為有的紙片，如青霉素類，在保存中因為受潮濕環(huán)境的影響容易降低其藥物的活性。因此，紙片應放低溫下（-10℃）保存，同時要避免潮濕，以保持抗菌藥物的活性。盛紙片小瓶自低溫處取出應在室溫平衡至少10min后再打開，避免冷凝水影響藥效。

C、細菌

由于各種菌對藥物的敏感性不同，產(chǎn)生的抑菌環(huán)大小不同，如果菌種不純，試驗中所產(chǎn)生的抑菌環(huán)大小與該菌種在純培養(yǎng)狀態(tài)下產(chǎn)生的抑菌環(huán)大小存在較大的差異，影響判斷結(jié)果的準確性。因此需要對各種致病菌提純后，分別進行不同的藥敏試驗。藥敏試驗時，需要將提純后的菌種配制成一定濃度的菌液。WHO組織制定的標準是要求菌液濃度在1.5億/mL左右。若菌液濃度過高，該菌會對所有藥物產(chǎn)生耐藥；反之，菌液濃度過低，該菌會對所有藥物均敏感。最精確的方法是使用分光光度計測定新鮮培養(yǎng)物菌懸液的吸光度，來確定菌液濃度。國家細菌耐藥性監(jiān)測網(wǎng)的三級甲等醫(yī)院，其微生物實驗室大多數(shù)用此法來確定藥敏試驗的菌液濃度。

藥敏試驗中要將菌液均勻地涂在培養(yǎng)基上，使細菌均勻分布，這樣才能使試驗結(jié)果不會出現(xiàn)較大的偏差。涂菌后15min才能貼藥敏紙片。由于涂菌后，細菌要有一段時間的適應過程，但是時間不能過長，否則會使細菌產(chǎn)生耐藥。貼藥敏紙片時，每取一種藥敏紙片必須燒一下鑷子口，避免藥敏紙片之間相互混淆，以提高藥敏的準確性。藥物殺滅細菌存在一定的量比，藥敏試驗培養(yǎng)基上細菌層越厚抑菌圈就越小，反之抑菌圈就越大。根據(jù)一種藥物抑菌圈的有無或者大小，只能判斷出該藥對細菌有沒有效果，但其敏感性的高低需要通過科學嚴謹?shù)膶嶒瀬泶_定。藥物的敏感程度需要根據(jù)藥敏試驗的結(jié)果，并結(jié)合以上因素做綜合分析，才能得出科學的結(jié)論，而片面地根據(jù)藥敏圈的大小來決定敏感與否，結(jié)果不夠準確。

D、培養(yǎng)時間

一般培養(yǎng)溫度和時間為37℃、8～18小時，有些抗菌藥擴散慢如多粘菌素，可將已放好抗菌藥的平板培養(yǎng)基，先置4℃冰箱內(nèi)2～4小時，使抗菌藥預擴散，然后再放37℃溫箱中培養(yǎng)，可以推遲細菌的生長，而得到較大的抑菌圈。

⑤應用于治療效果

藥物敏感實驗后，應選擇高敏藥物進行治療，也可選用兩種藥物協(xié)助使用，以減少耐藥菌株。在選擇高敏藥物時應考慮藥物的吸收途徑，因為藥敏實驗是藥液直接和細菌接觸，而在給禽用藥的時候，必須通過機體的吸收才能使藥物達到一定的效果，所以在給禽用藥時，高敏藥物一定要配合適宜的給藥方法，這樣才會達到好的治療效果。

此處介紹的是常用于簡易定性測試的，對于重要對象較精確的藥物敏感性試驗還應參考藥物專用資料，使用既定性又定量的牛津杯法或打孔法。