甲殼動物的抗菌肽

與陸地節(jié)肢動物源抗菌肽相比，甲殼動物源抗菌肽相對較少。自1996年Schnapp等從三葉真蟹（ Carcinus maenas）的血細胞溶解產(chǎn)物中首先分離到第一個富含脯氨酸抗菌肽以來，目前從甲殼動物體內(nèi)分離純化的抗菌肽主要有四類。

⑴ 對蝦素（Penaeidins）家族抗菌肽

①種類與結(jié)構(gòu) 

Penaeidins是從多種對蝦體內(nèi)中分離獲得的陽離子抗菌肽，等電點為9.34-9.84。通過分子生物學(xué)研究證實對蝦素家族抗菌肽共有5種，分別命名為 Pen-1、Pen-2、Pen-3、Pen-4 和Pen-5。其共同結(jié)構(gòu)特征是：分子中含有富含脯氨酸的N-末端和由6個半胱氨酸組成的3個分子內(nèi)二硫橋構(gòu)成的環(huán)狀C-末端。富含脯氨酸的N端結(jié)構(gòu)域在錨定微生物細胞膜中起著重要作用，而富含半胱氨酸的C端結(jié)構(gòu)域則起著抗菌作用，兩個結(jié)構(gòu)域的功能互為補充。Penaeidins成熟肽是由前體分子加工而來，Pen-3的翻譯后修飾,是通過將N末端谷氨酸變成焦谷氨酸而形成環(huán)狀；Pen-2和Pen-3的C末端在翻譯后加工時,因谷氨酸的酰胺化而被去除,這與其它海洋無脊椎動物中分離的抗菌肽C末端酰胺化作用相同。

②表達調(diào)控機制 

Penaeidins在血細胞中是以組成型合成,并貯存于顆粒細胞或半顆粒細胞的細胞質(zhì)中,不存在于透明細胞中。在脂多糖、β-葡聚糖或微生物的刺激下（半）顆粒細胞釋放包括抗菌肽在內(nèi)的內(nèi)含物至血淋巴中，參與抗菌反應(yīng)。研究發(fā)現(xiàn)Penaeidins的表達在蝦類無節(jié)幼體階段就已經(jīng)出現(xiàn)，不同對蝦個體間Penaeidins的相對表達量也有較大差異。Penaeidins的表達和分布主要通過血細胞總數(shù)的變化和細胞內(nèi)Penaeidins的釋放進行調(diào)控的。病原微生物感染早期由于表達Penaeidins的血細胞數(shù)量減少，引起Penaeidins mRNA濃度降低，Penaeidins表達量較少。 感染中期血淋巴和其他組織中的血細胞數(shù)量恢復(fù)至正常水平，Penaeidins mRNA進行高水平轉(zhuǎn)錄表達，血淋巴中Penaeidins濃度增高并轉(zhuǎn)運到微生物所在的局部發(fā)揮抗菌作用。

③ 生物學(xué)功能 

Penaeidins既具有抗真菌活性又具有抗細菌活性,并且還具有與幾丁質(zhì)相粘連的特性。其抗菌機制是在細菌細胞膜上形成孔洞，導(dǎo)致細菌裂解而死亡；抗真菌作用則是通過抑制絲狀真菌孢子的萌發(fā)和菌絲的生長而實現(xiàn)。Penaeidins與幾丁質(zhì)相粘連的功能使Penaeidins參與幾丁質(zhì)聚合以及傷口愈合的過程，對于維持對蝦在蛻皮周期中的防御保護機能是非常必要的。此外，penaeidin通過幾丁質(zhì)結(jié)合特性而結(jié)合到對蝦的表皮,進而防止微生物入侵。

⑵ 甲殼素（Crustins）類抗微生物肽

① 種類與結(jié)構(gòu) 

Crustins是在甲殼動物中發(fā)現(xiàn)的第二類陽離子抗菌肽，目前已在岸蟹、凡納濱對蝦、大西洋白對蝦、斑節(jié)對蝦、日本對蝦和刺龍蝦中發(fā)現(xiàn)有crustins存在。蟹類和蝦類的Crustins具有高度同源性，Crustins與其它抗菌肽和乳清酸蛋白家族（WAP）中的蛋白酶抑制劑也具有較高的同源性。

岸蟹Crustins的相對分子量為11.5KDa,結(jié)構(gòu)中富含疏水性甘氨酸和1個WAP結(jié)構(gòu)域；凡納濱對蝦Crustins的相對分子量為16.3KDa，氨基酸序列的N端含有25個氨基酸殘基組成的信號肽，隨后是大約50個甘氨酸組成的疏水區(qū)，C端是富含脯氨酸或半胱氨酸的序列，其中部分半胱氨酸參與形成二硫鍵，這也是與岸蟹Crustins的同源區(qū)域；凡納濱對蝦和大西洋白對蝦Crustins由163個氨基酸殘基組成，N端含有一個由18個氨基酸組成的信號肽，隨后是大約24個甘氨酸組成的疏水區(qū)，C端類似岸蟹Crustins，C端區(qū)域中含有l(wèi)2個半胱氨酸殘基和一個WAP結(jié)構(gòu)域；斑節(jié)對蝦Crustins與大西洋白對蝦和凡納濱對蝦Crustins結(jié)構(gòu)相似，也帶有一個由l8個氨基酸組成的信號肽，在C端結(jié)構(gòu)域中含有一段WAP蛋白保守區(qū)，但斑節(jié)對蝦的Crustins只含有11個半胱氨酸殘基，與大西洋白對蝦和凡納濱對蝦的Crustins在半胱氨酸數(shù)目和位置上存在著差異；在日本對蝦血細胞的cDNA文庫和PCR擴增中觀察到5種Crustins樣肽的cDNA，以Crustins-1的含量最豐富，其cDNA由679個核苷組成，ORF由573個堿基對組成，編碼一個由191個氨基酸殘基組成的肽；Crustins l-5在N端氨基酸序列中含有不同的富含甘氨酸重復(fù)區(qū)。日本對蝦Crustins1l-5的氨基酸序列與凡納濱對蝦、大西洋白對蝦的Crustins的同源性均為80% ，與岸蟹Crustins的同源性為44%；Stoss等在刺龍蝦的上皮細胞中也發(fā)現(xiàn)了一種Crustins樣肽，該肽在先天性免疫應(yīng)答中具有一定的作用。

②生物學(xué)功能

Crustins具有抗菌活性和蛋白酶抑制劑活性。在WAP結(jié)構(gòu)域中，N端帶正電荷的氨基酸和疏水性氨基酸的正確定位可使蛋白質(zhì)呈現(xiàn)出兩性分子特征，而兩性分子蛋白質(zhì)可以插入至微生物細胞膜中破壞膜結(jié)構(gòu)，從而起到抗菌作用。C端結(jié)構(gòu)域顯示蛋白酶抑制劑活性。與抗菌活性一樣，蛋白酶抑制劑活性在甲殼動物免疫應(yīng)答中起到一定作用，通過參與蛋白酶級聯(lián)反應(yīng)，防止蛋白酶的過量激活，從而避免宿主組織的自身損傷和抵抗病原微生物的感染。

（3）抗脂多糖因子（antilipopolysaccharid factor，ALF）

①種類與結(jié)構(gòu)

ALF最初發(fā)現(xiàn)于馬蹄蟹體內(nèi)，是一種具有抗菌作用和結(jié)合脂多糖（LPS）的多肽分子。此后，在白濱對蝦、斑節(jié)對蝦和中國明對蝦中也發(fā)現(xiàn)ALF，并且蝦類ALF與馬蹄蟹ALF具有較高的同源性。ALF的相對分子量約為11.5KDa，由102個氨基酸殘基組成，N端有20個高度疏水性氨基酸，在Cys32-Cys53間形成二硫鍵，二硫內(nèi)有保守的正電荷氨基酸。

②生物學(xué)功能

ALF能替換LPS分子中的Ca2＋，然后利用它的正電荷特性，結(jié)合到LPS的磷酸基團和羧基基團上，ALF與LPS結(jié)合后可以阻止啟動炎性細胞因子的級聯(lián)反應(yīng)，減少組織損傷。此外，LPS是革蘭氏陰性菌的內(nèi)毒素，ALF與LPS的毒性成分類脂A結(jié)合后，可破壞內(nèi)毒素的毒性作用。

（4）來自血藍蛋白的抗菌肽

①陰離子抗菌肽

Dexstoumieux-Garzon等從細角濱對蝦（Penaeus stylirostris）和凡納濱對蝦（Penaeus vannamei）的血淋巴中分離到3種具有抗真菌活性的陰離子抗菌肽。兩種來源于細角濱對蝦的酸性血漿，相對分子量分別為7.9KDa和8.3KDa，分別命名為 PsHctl和 PsHct2，PsHct1是PsHct2除去了部分殘基所得到的短肽；另一種來源于凡納濱對蝦，相對分子量為2.7KDa，命名為PvHct。3種陰離子抗菌肽與其他類型的抗菌肽沒有序列上的相似性，但與對蝦血藍蛋白的C端氨基酸具有95%～100%的同源性，表明它們是血藍蛋白的裂解片段。陰離子抗菌肽與陽離子抗菌肽最大的區(qū)別是它們在生理pH條件下帶負電荷，pI為5.65～6.54，分子結(jié)構(gòu)中不包含銅離子結(jié)合位點。通過免疫檢測發(fā)現(xiàn)受真菌感染的甲殼動物血淋巴中的陰離子抗菌肽濃度高于未被感染動物血淋巴中的陰離子抗菌肽濃度，說明陰離子抗菌肽與抗真菌免疫反應(yīng)有關(guān)。同時，通過體外抑菌試驗發(fā)現(xiàn)陰離子抗菌肽對革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌均未有抗菌活性，但對真菌顯示出廣譜的抗菌活性。

②Astacidin1Lee等應(yīng)用陽離子交換層析和反相HPLC從淡水小龍蝦（Pacifastacus leniusculus）的血淋巴中分離純化了一種具有16個氨基酸殘基組成的相對分子量為1.95KDa的抗菌肽，并命名為astacidin1。與小龍蝦血藍蛋白序列比較發(fā)現(xiàn)：它也是一種來源于血藍蛋白C端的抗菌肽，但與同樣來源于血藍蛋白C端的3種陰離子抗真菌肽無同源性。astacidin1的一級結(jié)構(gòu)序列為FKVQNQHGQVVKIFHH-COOH，不含糖殘基及半胱氨酸殘基。astacidin1的二級結(jié)構(gòu)中含有一個B-折疊結(jié)構(gòu)。Astacidin1對革蘭氏陽性和陰性菌均具有抗菌活性，但切去其氨基端后，抗菌活性明顯降低，說明astacidin1的氨基端部分是具有抗菌活性的主要區(qū)域。此外，脂多糖或葡聚糖可以刺激螯蝦血藍蛋白產(chǎn)生astacidin1。

③來自血藍蛋白抗菌肽的產(chǎn)生機制已有研究表明，許多抗菌肽都是由較大的前體蛋白加工后形成的。如蟾蜍素I是從亞洲蟾蜍胃腺細胞中的組蛋白H2A經(jīng)胃蛋白酶水解而形成的。從牛蜱腸中分離得到的一種3.2KDa抗菌肽是牛血紅蛋白的分解片段。此外，用人胃蛋白酶裂解牛乳鐵蛋白（Lactoferrin）后產(chǎn)生了具有更高抗菌活性的Lactoferricins片段。這說明金屬結(jié)合蛋白能通過蛋白酶水解作用產(chǎn)生抗菌肽而參加免疫防御反應(yīng)，也為來自血藍蛋白的甲殼動物抗菌肽的發(fā)現(xiàn)提供了一個佐證，因為它們是由結(jié)合銅的血藍蛋白產(chǎn)生的。

對蝦遭受病原微生物感染后，其血淋巴中可檢測到高濃度的PvHct，說明血藍蛋白的裂解不是由于抽提過程造成的，而是由生物學(xué)信號所引起的。雖然血藍蛋白的加工機制還不清楚，但推測它很可能是被來源于血細胞的酶所驅(qū)動的，因為甲殼動物在遭受病原微生物感染后，血細胞發(fā)生胞吐作用，胞吐作用有助于血藍蛋白裂解酶的釋放，從而使PvHct的濃度增加。astacidin1也是經(jīng)過半胱氨酸樣蛋白酶對血藍蛋白加工而形成的。因此，加深對這些酶的研究有助于揭示甲殼動物的免疫應(yīng)答機制以及血藍蛋白在防御中所起的作用。

④ 血藍蛋白與酚氧化酶

血藍蛋白是存在于節(jié)肢動物和軟體動物血淋巴中的含銅呼吸蛋白。血藍蛋白不僅具有運輸氧氣、調(diào)節(jié)滲透壓、貯存能量、調(diào)節(jié)蛻皮過程和合成黑色素等功能外，近年來研究表明，血藍蛋白及其降解片段還具有酚氧化酶活性、凝集素活性以及抗菌抗病毒等多種免疫學(xué)功能。雖然血藍蛋白的氨基酸序列與酚氧化酶的氨基酸序列顯示出高度同源性，但二者的合成部位不同。酚氧化酶在血細胞中表達，以酶原的形式合成，其氨基端被裂解后才發(fā)揮生物學(xué)活性，參與角質(zhì)硬化和免疫防御反應(yīng)；血藍蛋白則是在肝胰腺中合成并釋放至血漿中的。