解讀：河豚腸道微生物群研究揭示獨(dú)特的細(xì)菌共生模式的新見解

河豚毒素（Tetrodotoxin，TTX）是一種主要從有毒河豚魚中提取的強(qiáng)效神經(jīng)毒素。迄今為止，TTX在其宿主體內(nèi)的生物合成機(jī)制仍未解決。在這里，我們假設(shè)TTX的合成依賴于宿主腸道微生物群，包括被忽視的不可培養(yǎng)細(xì)菌。在這些研究中，我們收集了5種河豚屬河豚魚的腸道內(nèi)容物，包括一個(gè)疑似雜交種，通過16S rRNA擴(kuò)增子和宏基因組學(xué)方法進(jìn)行腸道微生物群研究。根據(jù)LC-MS/MS檢測(cè)到的TTX濃度，將其腸道樣本分為有毒和無毒兩組。細(xì)菌多樣性研究表明，有毒和無毒物種的腸道微生物群落結(jié)構(gòu)存在顯著差異?；【退{(lán)藻集中在腸道細(xì)菌共生網(wǎng)絡(luò)，表明它們?cè)赥TX生物合成中的重要性。PICRUSt2宏基因組預(yù)測(cè)和基因集富集分析的結(jié)果為TTX生物合成所需的精氨酸前體提供了新的支持。這是第一個(gè)利用16S rRNA擴(kuò)增子和宏基因組方法分析有毒和無毒河豚魚腸道微生物群的研究，確定了它們腸道環(huán)境中重要的微生物共生模式。我們的數(shù)據(jù)支持了以精氨酸為前體的腸道細(xì)菌共生體在宿主體內(nèi)合成TTX的提議。

魚類腸道環(huán)境中有一個(gè)細(xì)菌庫(kù)，它是維持魚類代謝穩(wěn)態(tài)的重要功能單元。產(chǎn)TTX的細(xì)菌通常從河豚的腸道環(huán)境中分離出來。盡管信號(hào)觸發(fā)或食物偏好等固有因素可能決定了TTX的生物合成，但河豚腸道中獨(dú)特的細(xì)菌共生體也至關(guān)重要。因此，對(duì)河豚等含TTX魚類腸道菌群的分析和綜合研究，對(duì)于發(fā)現(xiàn)TTX生物合成的關(guān)鍵因子或生物標(biāo)志物具有重要意義。細(xì)菌多樣性先前已通過聚合酶鏈反應(yīng)方法在含TTX的宿主中進(jìn)行了研究。然而，只有一小部分腸道細(xì)菌被鑒定出來。大多數(shù)已報(bào)道的產(chǎn)TTX細(xì)菌僅限于實(shí)驗(yàn)室中可培養(yǎng)的細(xì)菌，未培養(yǎng)細(xì)菌對(duì)TTX生物合成的貢獻(xiàn)被低估。

到目前為止，第二代測(cè)序已經(jīng)發(fā)展成熟，可以通過16S rRNA擴(kuò)增子和宏基因組學(xué)進(jìn)行細(xì)菌群落研究。利用高通量測(cè)序技術(shù)，我們利用最新的生物信息學(xué)工具在不同種類河豚的腸道環(huán)境中進(jìn)行了細(xì)菌譜學(xué)研究。據(jù)我們所知，這是第一個(gè)用NGS方法分析河豚腸道微生物群的研究，它將區(qū)分有毒和無毒物種的腸道細(xì)菌結(jié)構(gòu)，并確定與TTX生物合成相關(guān)的獨(dú)特細(xì)菌共生體。我們的研究還將通過元基因組預(yù)測(cè)來確定TTX生物合成的潛在前體，并闡明它們與河豚腸道環(huán)境中細(xì)菌共生體的關(guān)系。

結(jié)果與討論

有毒和無毒河豚的毒性和腸道菌群比較

在本研究中，養(yǎng)殖河豚與野生河豚的生活環(huán)境相似。暗紋東方鲀的體重和體長(zhǎng)均顯著大于野生種，說明暗紋東方鲀的食物供給較野生種充足、穩(wěn)定。暗紋東方鲀中的TTX含量是不可檢測(cè)的，這與之前的研究一致，即有毒河豚魚在養(yǎng)殖后會(huì)變得無毒。野生但無毒的河豚物種為TTX的起源提供了有價(jià)值的線索。在我們的研究中，黃鰭東方鲀和暗紋東方鲀的微生物豐富度顯著高于有毒物種。此外，基于UniFrac的PCoA和PERMANOVA試驗(yàn)也表明有毒和無毒河豚腸道微生物群的微生物結(jié)構(gòu)存在顯著差異。在生活環(huán)境相同的情況下，黃鰭東方鲀和其他野生有毒河豚腸道微生物群的差異可能是由它們的飲食造成的，這可能改變整個(gè)魚類腸道微生物結(jié)構(gòu)。雖然河豚的固有因素可能會(huì)影響細(xì)菌組成，但最近關(guān)于不同魚類飲食改變草魚中膽汁酸組成以及腸道細(xì)菌組成的研究表明，飲食在形成腸道微生物群方面的重要性。因此，本研究推測(cè)黃鰭東方鲀可能與其他野生河豚有不同的食物偏好，最終形成不同的腸道微生物群結(jié)構(gòu)。

圖1. LC-MS/MS法測(cè)定河豚肝中河豚毒素（TTX）含量。（a）TTX標(biāo)準(zhǔn)品和樣品的MRM2（m/z320.00～m/z161.80）色譜圖。（b） TTX內(nèi)容方框圖。毒性種間平均TTX含量采用威爾科克森秩和檢驗(yàn)進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)（***p值<0.001；NS：不顯著）。STD:標(biāo)準(zhǔn)；TObs: T. obscurus; TXan: T. xanthopterus; TBim: T. bimaculatus; TOce: T. ocellatus; TOceH: hybrid suspected T. ocellatus。

在這項(xiàng)研究中，我們發(fā)現(xiàn)所有物種中最主要的門是變形桿菌，這與之前關(guān)于T. obscures可培養(yǎng)細(xì)菌的研究一致。通過16S rRNA亞基因組研究，擴(kuò)展了對(duì)河豚腸道優(yōu)勢(shì)菌的認(rèn)識(shí)。我們發(fā)現(xiàn)大量螺旋體、厚壁菌和擬桿菌（圖2a）也構(gòu)成了有毒、無毒、野生捕撈和養(yǎng)殖河豚魚的腸道微生物群組成。由于分類學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)的不足，大多數(shù) OTUs的系統(tǒng)發(fā)育分類無法準(zhǔn)確獲得。然而，在ANCOM測(cè)試中，在物種水平上分類的許多 OTUs顯著分化（圖2e）。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，有毒物種中有大量的Aliivibrio fischeri。此外，在有毒物種的腸道環(huán)境中也大量發(fā)現(xiàn)弧菌屬，表明弧菌屬和alivibrio屬在有毒物種的細(xì)菌群落中的作用可能比無毒物種更為重要。最近的研究表明，細(xì)菌共生體受到霍亂弧菌VI型分泌系統(tǒng)的不利影響，這可以解釋在功能上受弧菌控制的有毒腸道環(huán)境中微生物豐富度顯著降低的原因。獨(dú)特的腸道微生物群可能是由有毒河豚物種獨(dú)特的食物偏好形成的，這可能隨后為TTX生物合成創(chuàng)造必要的條件。另一方面，最近的研究表明，在有毒河豚（Chelonodon patoca）中經(jīng)常檢測(cè)到扁平扁虱序列，這表明有毒河豚通過捕食扁平扁虱卵來積累TTX。然而，無論是TTX的產(chǎn)生機(jī)制，還是扁形蟲消化系統(tǒng)中的細(xì)菌組成，都沒有被研究。平頭扁形蟲或其他TTX載體如章魚可能在消化系統(tǒng)中具有類似的TTX生物合成的細(xì)菌基調(diào)。本研究為有毒和無毒河豚腸道菌群的進(jìn)一步研究提供了參考。

圖2. 河豚腸道微生物結(jié)構(gòu)及多樣性。（a） 操作分類單元（OTUs）在門水平上的相對(duì)豐度。相對(duì)豐度小于1%的門被歸入“其他門”。（b） 最新分類水平的前十大OTU相對(duì)豐度。前十名以外的相對(duì)豐度較低的otu被分配給“其他”。（c） Chao1α多樣性箱線圖。種間方差分析和毒性組（N=24）與非毒性組（N=18）的韋爾奇T檢驗(yàn)進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)。*p<0.05。（d） 不加權(quán)UniFrac原理坐標(biāo)分析?？招臋E圓和實(shí)心橢圓分別代表按河豚種類和毒性分組的樣本聚類（95%置信度）。PERMANOVA（999次排列）檢驗(yàn)其顯著性。（e） ANCOM c測(cè)試火山圖。Log2FC > 0/Log2FC < 0的點(diǎn)代表有毒/無毒河豚腸道微生物群中的OTUs。虛線分隔了顯著不同的OTUs（上圖）和不顯著的OTUs（下圖）。TObs: T. obscurus; TXan: T. xanthopterus; TBim: T. bimaculatus; TOce: T. ocellatus; TOceH: hybrid suspected T. ocellatus。

弧菌屬和 Calotrichaceae（藍(lán)藻）產(chǎn)TTX的共生體

在這項(xiàng)研究中，發(fā)現(xiàn)有毒物種腸道環(huán)境中的細(xì)菌在ANCOM測(cè)試中一致，顯示出明顯的豐度，而網(wǎng)絡(luò)集中度顯示了細(xì)菌群落中的功能重點(diǎn)。例如，布氏瘤胃球菌和Aliivibrio fischeri在毒性組中均表現(xiàn)出明顯的豐度（ANCOM檢驗(yàn)）和網(wǎng)絡(luò)中心性，表明它們之間可能存在聯(lián)系或參與TTX的生物合成。瘤胃球菌在河豚腸道環(huán)境中的作用尚不清楚。然而，檢測(cè)食用非淀粉多糖的Siganus canicallatus腸道中發(fā)現(xiàn)的瘤胃球菌種類表明瘤胃球菌種類在魚腸道纖維素降解中的作用。此外，瘤胃球菌中豐富多樣的纖維素降解酶將多糖轉(zhuǎn)化為其他細(xì)菌共生體和宿主的營(yíng)養(yǎng)源，揭示了它們?cè)谀c道環(huán)境中的關(guān)鍵作用。

圖3河豚腸道微生物共生網(wǎng)絡(luò)分析。（a） OTU級(jí)共現(xiàn)網(wǎng)絡(luò)。顯示Spearman-rho閾值>0.8和p值<0.05的共現(xiàn)對(duì)。邊緣顯示節(jié)點(diǎn)之間的正（紅色）和負(fù)（藍(lán)色）關(guān)系。每個(gè)河豚組的網(wǎng)絡(luò)中心性被強(qiáng)調(diào)。（b） 分支圖顯示河豚腸道網(wǎng)絡(luò)中心性的共同樹及其相對(duì)豐度百分比（%RLA）。用威爾科克森秩和檢驗(yàn)（WT）比較了有毒（N=24）和無毒（N=18）河豚的相對(duì)豐度（*p<0.05，**p<0.01，**p<0.001；NS：不顯著）。TObs: T. obscurus; TXan: T. xanthopterus; TBim: T. bimaculatus; TOce: T. ocellatus; TOceH: hybrid suspected T. ocellatus。

與R. bromii的發(fā)現(xiàn)相似，Aliivibrio fischeri也被發(fā)現(xiàn)是有毒河豚腸道環(huán)境中的網(wǎng)絡(luò)中心，與無毒組相比，其豐度顯著更高。Aliivibrio fischeri是一種產(chǎn)TTX的細(xì)菌，發(fā)現(xiàn)于花紋愛潔蟹（Atregatis floridus）。其在有毒河豚內(nèi)臟中的相對(duì)優(yōu)勢(shì)直接暗示了其與TTX生物合成的密切關(guān)系。此外，代表弧菌種類的濃度主要在有毒河豚中發(fā)現(xiàn)（圖3b）。其中，V. gigantis、V. renipiscarius的產(chǎn)TTX能力尚不清楚。然而，它們最初是從海洋物種中分離出來的，并被認(rèn)為在海洋環(huán)境中定殖于河豚。次級(jí)代謝產(chǎn)物經(jīng)常出現(xiàn)在由弧菌組成的共生細(xì)菌群落中。雖然弧菌是最常見的產(chǎn)TTX細(xì)菌屬，但沒有成功分離出能持續(xù)生產(chǎn)TTX的弧菌菌株。關(guān)于這一事實(shí)，由弧菌組成的共生體或潛在的誘因被懷疑是TTX生物合成的原因。

除了弧菌物種外，在有毒樣品的微生物共生網(wǎng)絡(luò)中發(fā)現(xiàn)了屬于藍(lán)藻譜系的Calotrichaceae（圖3a，b）。很少有研究報(bào)道在河豚的腸道環(huán)境中存在藍(lán)藻。然而，作為海洋環(huán)境的主要棲息生物，藍(lán)藻可以被動(dòng)地進(jìn)入河豚的腸道。先前的研究表明藍(lán)藻是霍亂弧菌的宿主。因此，在本研究中，弧菌與藍(lán)藻可能在有毒河豚的腸道環(huán)境中形成共生關(guān)系。藍(lán)藻是已知的負(fù)責(zé)石房蛤毒素（STX）生物合成的細(xì)菌，其結(jié)構(gòu)與TTX具有相似的胍基。河豚以前被發(fā)現(xiàn)同時(shí)產(chǎn)生TTX和STX，表明它們的非排他性關(guān)系。STX的生物合成是通過藍(lán)藻中大量的基因簇來實(shí)現(xiàn)的。在TTX的情況下，編碼TTX生物合成的確切基因或基因簇是未知的?；【退{(lán)藻在有毒河豚腸道環(huán)境中的顯著共存可能決定了TTX的生物合成。然而，TTX和STX在生物合成過程中是否相互關(guān)聯(lián)，如共享相似的前體或中間產(chǎn)物尚不清楚，需要進(jìn)一步研究。

另一方面，雖然在無毒河豚中也發(fā)現(xiàn)了弧菌，但只有一種被定義為網(wǎng)絡(luò)中心，即弧菌在無毒河豚腸道環(huán)境中的作用不如在有毒河豚腸道環(huán)境中重要。除了弧菌和藍(lán)藻外，本研究還發(fā)現(xiàn) 波羅的海希瓦氏菌和Pseudoalteromonas neustonica 是有毒河豚的網(wǎng)絡(luò)中心，盡管與無毒組相比，它們的相關(guān)性并不顯著。在希瓦氏菌屬和Pseudoalteromonas屬中，分別鑒定出未知種的Nassarius semiplicatus和Nassarius semiplicatus 為TTX產(chǎn)生菌。因此，在本研究中發(fā)現(xiàn)的巴爾的沙瓦氏菌和偽交替單胞菌也可能有助于TTX的生物合成。然而，盡管擴(kuò)增子序列較短，但細(xì)菌染色水平的鑒定仍有困難，因此本研究還需要進(jìn)一步的研究來確定希瓦氏菌屬和Pseudoalteromonas屬的確切菌株。

形成有毒和無毒河豚腸道微生物群的因素多種多樣。河豚腸道內(nèi)細(xì)菌共生體組成的變化可以確定TTX的存在。Moritella sp.、Eionea sp.、 Methylophaga sp.、 Rhodobacter sp.、Desulfovibrio sp.和Calotrichaceae在有毒河豚中的獨(dú)家發(fā)現(xiàn)及其作為網(wǎng)絡(luò)中心的重要性強(qiáng)烈表明，有毒樣品的腸道環(huán)境滿足了它們作為共生體的生長(zhǎng)，這也有利于TTX作為次級(jí)代謝物的生物合成。我們的研究確定了腸道細(xì)菌共生體的主要組成部分弧菌屬和藍(lán)藻。弧菌和藍(lán)藻的體外共培養(yǎng)可以進(jìn)一步驗(yàn)證共生體中TTX的生物合成。

與TTX生物合成有關(guān)的代謝途徑

精氨酸被認(rèn)為是TTX生物合成的前體，作為TTX中胍部分的氨基供體，然而，尚未得到證實(shí)。在這項(xiàng)研究中，PICRUSt2基因組預(yù)測(cè)和GSEA結(jié)果預(yù)測(cè)，與無毒河豚相比，有毒河豚腸道微生物群中的精氨酸生物合成明顯更活躍，這支持了先前的建議。谷氨酸的精氨酸生物合成在不同的細(xì)菌以及弧菌和藍(lán)藻中有很好的記錄?；【退{(lán)藻中精氨酸生物合成的模式是相同的，谷氨酸被催化生成精氨酸、瓜氨酸、精氨琥珀酸，最后生成精氨酸，在我們的研究中，所有編碼催化的基因在有毒河豚的腸道微生物群中顯著富集。盡管河豚體內(nèi)的其他腸道細(xì)菌也可能參與精氨酸的生物合成，但弧菌和藍(lán)藻在腸道微生物群共生體中的相同生物合成模式和關(guān)鍵作用至少表明它們參與了有毒河豚腸道環(huán)境中的精氨酸生物合成。在弧菌和藍(lán)藻中大量發(fā)現(xiàn)的非核糖體肽合成酶（NRPS）被懷疑利用精氨酸結(jié)合TTX的胍部分。然而，NRPS的存在及其與TTX生物合成的關(guān)系有待進(jìn)一步研究。

圖4. PICRUSt2 KEGG Orthology（KO）預(yù)測(cè)、區(qū)分和基因集富集結(jié)果。（a） MA圖顯示毒性組（N=24）和無毒組（N=18）之間通過ALDEx2算法確定的顯著不同KOs。BH校正p值<0.01且效應(yīng)大小>1（毒性組明顯）或效應(yīng)大小<1（無毒組明顯）的KOs被認(rèn)為是顯著不同的。只有效應(yīng)大小>1和BH調(diào)整p值<0.01的KOs用于隨后的基因集富集分析。（b） 顯著富集KEGG路徑條圖。基因集富集分析（GSEA）中校正p值<0.05的KEGG通路被認(rèn)為是顯著富集的（富集分?jǐn)?shù)>0：在毒性組富集；<0：在無毒組富集）。（c） 精氨酸生物合成。通過ALDEx2分析，顯示了顯著上調(diào)/下調(diào)（紅色/藍(lán)色）的KOs和非顯著上調(diào)/下調(diào)（灰色）的KOs。

除了精氨酸生物合成的發(fā)現(xiàn)外，霍亂弧菌生物膜形成的途徑在有毒河豚魚腸道環(huán)境中被發(fā)現(xiàn)顯著富集，這進(jìn)一步強(qiáng)調(diào)了弧菌在河豚腸道環(huán)境中精氨酸生物合成以及TTX生物合成中的重要性。雖然弧菌的菌株水平并不常見，但弧菌屬經(jīng)常出現(xiàn)在海洋魚類的腸道環(huán)境中。最近的研究表明，抗生素誘導(dǎo)的魚類腸道細(xì)菌豐富度和多樣性的減少增加了機(jī)會(huì)弧菌在腸道環(huán)境中的優(yōu)勢(shì)。根據(jù)我們的研究，發(fā)現(xiàn)有毒河豚腸道環(huán)境中的微生物豐度顯著較低，弧菌集中在細(xì)菌共生網(wǎng)絡(luò)中，相對(duì)豐度顯著高于無毒腸道環(huán)境。結(jié)合毒性組霍亂弧菌生物膜形成相關(guān)代謝途徑的發(fā)現(xiàn)，我們懷疑機(jī)會(huì)性弧菌可能主導(dǎo)了有毒河豚魚的腸道環(huán)境，并可能參與了TTX的生物合成。發(fā)現(xiàn)機(jī)會(huì)弧菌在體外和體內(nèi)的表達(dá)不同，這可以解釋弧菌在體外的低TTX檢測(cè)。然而，特定的未知或未確認(rèn)的弧菌菌株可能是TTX產(chǎn)生的原因，這有待進(jìn)一步確認(rèn)。

(來源： 水生動(dòng)物健康評(píng)估 南湖意)