細(xì)胞培養(yǎng)工藝的早期開發(fā)

抗體藥物的生產(chǎn)主要涉及細(xì)胞培養(yǎng)、分離純化和制劑灌裝三個主生產(chǎn)單元，其中細(xì)胞培養(yǎng)工序過程復(fù)雜，影響因素繁多，對蛋白的表達(dá)量和質(zhì)量起著關(guān)鍵性的作用。動物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)跨越百年，從茹毛飲血初期的簡單維持細(xì)胞存活，到現(xiàn)代化培養(yǎng)生產(chǎn)具有重要醫(yī)用價值的酶、生長因子、疫苗和單抗等，細(xì)胞培養(yǎng)工藝開發(fā)的內(nèi)容及訴求正發(fā)生著翻天覆地的變化。

哺乳動物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)是生產(chǎn)抗體類藥物最主要的技術(shù)手段，相對于微生物或者其它哺乳動物細(xì)胞，中國倉鼠卵巢細(xì)胞（CHO細(xì)胞）因其特有的優(yōu)勢被廣泛使用。細(xì)胞培養(yǎng)方式主要包括批次培養(yǎng)（Batch）、流加培養(yǎng)（Fed-batch）和灌流培養(yǎng)（Perfusion），其中流加培養(yǎng)因操作簡單、易于放大、靈活、穩(wěn)定、以及重復(fù)性好等優(yōu)點，已成為當(dāng)今抗體類藥物生產(chǎn)的主流方式。過去近30年中，得益于高度設(shè)計化的化學(xué)成分限定培養(yǎng)基及補(bǔ)料，利用高通量小規(guī)模培養(yǎng)體系在工藝條件下進(jìn)行的克隆篩選，以及關(guān)鍵細(xì)胞培養(yǎng)參數(shù)的優(yōu)化等，使得抗體上游流加培養(yǎng)工藝的產(chǎn)量大大提升。

工藝開發(fā)的目的在于設(shè)計一個高質(zhì)量的產(chǎn)品，以及能持續(xù)生產(chǎn)出符合其預(yù)期質(zhì)量水平產(chǎn)品的生產(chǎn)工藝。從藥品研發(fā)和生產(chǎn)經(jīng)驗中所獲得的信息與知識，為建立設(shè)計空間、質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)和生產(chǎn)控制提供了科學(xué)的依據(jù)（ICH Q8）。其次，在確保抗體藥物安全有效的基礎(chǔ)上盡可能提高產(chǎn)量以降低成本、提高經(jīng)濟(jì)效益。培養(yǎng)工藝的開發(fā)和優(yōu)化主要包括兩大方面，一是培養(yǎng)基，二是工藝參數(shù)。通常所用的培養(yǎng)基可以分為傳代培養(yǎng)基、生產(chǎn)培養(yǎng)基和補(bǔ)料培養(yǎng)基。CHO細(xì)胞無血清培養(yǎng)基營養(yǎng)成分復(fù)雜，有些商業(yè)化培養(yǎng)基甚至多達(dá)90多種，并且不同的營養(yǎng)成分之間可能還存在交互作用。因此，對于部分生物藥企業(yè)來說，研發(fā)前期若要自主研發(fā)一款適合大規(guī)模CHO細(xì)胞培養(yǎng)的培養(yǎng)基較費時、費力和費錢。為了提高研發(fā)效率，加快項目推進(jìn)，大多數(shù)藥企采用成熟的進(jìn)口或國產(chǎn)商業(yè)化培養(yǎng)基組合來篩選出適合自己項目的培養(yǎng)基。細(xì)胞培養(yǎng)工藝參數(shù)的研究，通常會基于經(jīng)驗知識和平臺知識篩選出潛在的關(guān)鍵工藝參數(shù)進(jìn)行開發(fā)研究，比如初始接種密度、培養(yǎng)溫度、降溫溫度、降溫時間、補(bǔ)料策略、滲透壓等參數(shù)在搖瓶規(guī)?；蚍磻?yīng)器規(guī)模進(jìn)行單因素或DoE設(shè)計研究，以確定影響關(guān)鍵質(zhì)量屬性的工藝參數(shù)及設(shè)定范圍，選擇穩(wěn)健高產(chǎn)的細(xì)胞培養(yǎng)生產(chǎn)工藝。初始接種密度越高則到達(dá)活細(xì)胞密度峰值的時間越早，產(chǎn)量越高，但是細(xì)胞活率的維持可能會受到影響；培養(yǎng)溫度越高則細(xì)胞生長越快，但會影響培養(yǎng)后期細(xì)胞活率維持狀態(tài)以及影響蛋白質(zhì)量屬性（例如糖型、電荷異構(gòu)體等）；pH的控制一般維持在6.6-7.4之間，降低pH可降低乳酸的積累水平和降低蛋白酸性峰含量；高的攪拌轉(zhuǎn)速有助于提高Kla，促進(jìn)氧傳質(zhì)，但同時會產(chǎn)生較大的剪切力，對細(xì)胞活性的維持產(chǎn)生不利的影響；補(bǔ)料策略主要是針對補(bǔ)料的體積及補(bǔ)料的時間進(jìn)行研究，補(bǔ)料培養(yǎng)基是濃縮的營養(yǎng)培養(yǎng)基，會影響細(xì)胞的生長代謝、蛋白表達(dá)以及翻譯后修飾，補(bǔ)料量過多或不足對細(xì)胞的代謝或蛋白的合成都會產(chǎn)生不利的影響。

DoE是工藝開發(fā)及優(yōu)化過程中必不可少的基礎(chǔ)工具之一，DoE是一種設(shè)計實驗并分析所獲得信息的技術(shù)。這種技術(shù)可以使我們在最小數(shù)量的實驗中建立實驗參數(shù)與結(jié)果的數(shù)學(xué)模型，找到最佳工藝條件，確定工藝的操作窗口。

針對不同的項目，應(yīng)選擇合適的工藝參數(shù)和DoE進(jìn)行研究，DoE主要流程包括以下幾個步驟：

1.明確實驗?zāi)康幕蚬に囬_發(fā)、優(yōu)化的目標(biāo)；

2.根據(jù)產(chǎn)品概況和平臺經(jīng)驗，基于科學(xué)的風(fēng)險評估，根據(jù)實驗?zāi)康暮Y選出潛在影響的關(guān)鍵工藝參數(shù)（qCPP）和研究的關(guān)鍵質(zhì)量屬性（CQA）；

3.根據(jù)待研究參數(shù)的數(shù)量和平臺經(jīng)驗，選擇合適的實驗設(shè)計方法；

4.執(zhí)行試驗

5.獲得數(shù)據(jù)并初步核對數(shù)據(jù)的科學(xué)性和可信度；

6.選擇專業(yè)的分析方法進(jìn)行數(shù)據(jù)分析；

7.最終得出科學(xué)的結(jié)論

結(jié)合實際的項目經(jīng)驗，與大家分享一個應(yīng)用DoE方法來提高蛋白表達(dá)量和降低聚體比例的案例：

01

實驗?zāi)康?/span>

提高蛋白表達(dá)量（＞5g/L），降低聚體比例(＜4%)，電荷異構(gòu)體比例符合預(yù)期設(shè)定值；

02

實驗設(shè)計

根據(jù)該項目前期的數(shù)據(jù)積累以及平臺經(jīng)驗，選擇滲透壓、降溫時間和補(bǔ)料策略作為研究因子，Titer、SEC和CEX作為響應(yīng)變量，采用Full Factorial Design設(shè)計方法，具體實驗設(shè)計方案如下：

表1. 實驗設(shè)計（DoE）

03

執(zhí)行實驗并得到數(shù)據(jù)

04

應(yīng)用ANOVA進(jìn)行數(shù)據(jù)分析

圖1. 因子與響應(yīng)變量之間的相關(guān)系數(shù)圖

圖2. 蛋白表達(dá)量的等高線圖

圖3. 蛋白聚體比例的等高線圖

圖4. 電荷異構(gòu)體酸性峰比例的等高線圖

圖5. 電荷異構(gòu)體主峰比例的等高線圖

05

確定工藝操作窗口

即Sweet spot。

圖6. 工藝參數(shù)的Sweet spot圖

很多行業(yè)小伙伴都很關(guān)心，工藝開發(fā)和優(yōu)化應(yīng)該做到什么程度，做幾輪可以滿足IND申報及相關(guān)法規(guī)要求，回答這些問題前，我們首先需要了解產(chǎn)品的三大要素，即安全、有效、質(zhì)量可控，任何藥物的研發(fā)必須建立在安全性的基礎(chǔ)上來考慮有效性，質(zhì)量可控是藥物安全性和有效性的保障。其次，應(yīng)綜合考慮產(chǎn)品的特點、推進(jìn)速度、經(jīng)濟(jì)和成本等方面。對于一些特殊產(chǎn)品而言，假如采用平臺工藝不能生產(chǎn)出符合要求的臨床樣品，這時候需要對特定的問題（比如聚體偏高、糖基化修飾以及原液顏色等）開展合適的工藝優(yōu)化實驗以提供針對性的解決方案。對于常規(guī)抗體項目而言，細(xì)胞培養(yǎng)工藝研究的技術(shù)路線一般包括三輪研究，第一輪培養(yǎng)基篩選、第二輪工藝參數(shù)研究、第三輪工藝放大確認(rèn)。

目前，尚健生物上游工藝開發(fā)部已搭建了成熟的流加批次培養(yǎng)工藝開發(fā)平臺（圖7），完成了多個不同項目（包括融合蛋白、單抗、雙抗）的工藝開發(fā)、技術(shù)轉(zhuǎn)移，蛋白表達(dá)量均在4-8 g/L之間，成功完成了若干項目的200 L或2000 L規(guī)模的放大生產(chǎn)，工藝穩(wěn)健。

圖7. 三大工藝開發(fā)平臺

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