納米抗體的發(fā)現(xiàn)及結(jié)構(gòu)特點(diǎn)

摘要

納米抗體是在駱駝科及鯊魚科動(dòng)物血清中大量存在的一種天然抗體，與常規(guī)單克隆抗體相比，納米抗體缺失輕鏈，其重鏈可變區(qū)VHH的CDR3區(qū)較長(zhǎng)，是目前已知的可結(jié)合抗原的最小單位。特殊的結(jié)構(gòu)特征和性質(zhì)賦予了其一些其它常規(guī)抗體或抗體片段所不具有的特性。本文講從納米抗體的發(fā)現(xiàn)，結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，生化特性及藥物研發(fā)現(xiàn)狀四個(gè)方面做一簡(jiǎn)要概述。

1 納米抗體的發(fā)現(xiàn)

近年來，隨著抗體藥物不斷應(yīng)用于更多治療領(lǐng)域，抗體藥物的治療機(jī)理變得更為復(fù)雜，同時(shí)抗體藥物的結(jié)構(gòu)也變得更為多樣化。納米抗體（nanobodies，Nbs）因具有較小的相對(duì)分子質(zhì)量，其獨(dú)特的分子結(jié)構(gòu)使其適用于疾病診斷治療等諸多領(lǐng)域，當(dāng)前得到了廣泛的關(guān)注。納米抗體的發(fā)現(xiàn)是在上世紀(jì)80年代，比利時(shí)布魯塞爾自由大學(xué)的免疫學(xué)教授Hamers遇到了兩個(gè)大學(xué)生向他抱怨學(xué)校安排的實(shí)驗(yàn)課程結(jié)果都是已知的，沒有挑戰(zhàn)性。于是Hamers教授將冰箱中剩余的半升用于研究昏睡病的駱駝血讓學(xué)生Muyldermans等人嘗試從中提純駱駝的抗體。Muyldermans等人驚奇地發(fā)現(xiàn)，從駱駝血液中提純的抗體中有一部分不屬于所有脊椎動(dòng)物的標(biāo)準(zhǔn)類型，而是一種完全新型的、更簡(jiǎn)單的變種抗體，這樣的結(jié)果讓所有人都很疑惑。Hamers立刻成立了研究小組對(duì)這種抗體進(jìn)行專門研究，至此，駱駝抗體就從一個(gè)學(xué)生的實(shí)驗(yàn)迅速演變?yōu)镠amers和同事研究的主要項(xiàng)目。1993年，Hamers等首次在《自然》雜志中報(bào)道，在駱駝科及鯊魚科動(dòng)物血清中大量存在一種天然缺失輕鏈的重鏈抗體（heavy-chain antibody，HcAb）。與常規(guī)單克隆抗體相比，除了缺少輕鏈外，其重鏈可變區(qū)與鉸鏈區(qū)之間沒有CH1區(qū)，只含有一個(gè)重鏈可變區(qū)（VHH）和兩個(gè)常規(guī)的CH2與CH3區(qū)（圖1）。重鏈抗體的VHH片段與常規(guī)抗體的VH特征不同，但單獨(dú)克隆并表達(dá)出來的VHH結(jié)構(gòu)具有與原重鏈抗體相當(dāng)?shù)慕Y(jié)構(gòu)穩(wěn)定性以及與抗原的結(jié)合活性，是目前已知的可結(jié)合目標(biāo)抗原的最小單位。結(jié)構(gòu)解析結(jié)果表明：VHH晶體寬為2.5nm，長(zhǎng)4.8nm，分子量只有約15KDa，因此也被稱作納米抗體（Nanobody）。

圖1 不同形式抗體示意圖

2 納米抗體的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)

與常規(guī)單克隆抗體的VH折疊結(jié)構(gòu)相似，納米抗體的晶體和水溶性結(jié)構(gòu)兩個(gè)β片層組成支架。VHH的CDR3區(qū)較長(zhǎng)，人和小鼠抗體VH的CDR3區(qū)平均長(zhǎng)度為9-12個(gè)氨基酸，VHH的CDR3區(qū)為16-18個(gè)氨基酸?？勺儏^(qū)的擴(kuò)大能夠形成更豐富的抗原結(jié)合構(gòu)象，在一定程度上彌補(bǔ)了輕鏈缺失導(dǎo)致結(jié)合力下降的不足，從而使得納米抗體本身具有較強(qiáng)的抗原結(jié)合能力。納米抗體的CDR3區(qū)可形成一個(gè)特殊的凸環(huán)，凸環(huán)大部分折疊在FR2上，這里疏水殘基受到保護(hù)，可避免與外界水環(huán)境接觸。凸環(huán)中的半胱氨酸與CDR1（或FR2）區(qū)的半胱氨酸形成二硫鍵從而使其結(jié)構(gòu)穩(wěn)定。該凸環(huán)結(jié)構(gòu)能夠結(jié)合酶的裂隙或是凹穴，因此能夠很好的成為酶的抑制劑、受體的激動(dòng)劑或拮抗劑。

在常規(guī)單克隆抗體VH的FR2區(qū)，有四個(gè)氨基酸參與了與VL的相互作用，這四個(gè)氨基酸分別為V37、G44、L45、W47。而在納米抗體VHH中，這四個(gè)氨基酸發(fā)生了突變，分別為F（Y）37、E44、R45、G47。這四個(gè)位點(diǎn)的變化不但使VHH保持了較好的特異性和親和性，還使其具有高親水性，從而能夠保持穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)（如圖2所示）。

納米抗體VHH基因由VH家族的亞族III進(jìn)化而來，其豐富的基因序列多樣性使得重鏈抗體可形成大量不同結(jié)構(gòu)形式的凸環(huán)。人類VH3與駱駝VHH胚系基因具有高度的同源性，因此只需對(duì)VHH基因進(jìn)行較少的改變即可實(shí)現(xiàn)抗體人源化，通過基因工程技術(shù)獲得高親和力、高特異性、高穩(wěn)定性的納米抗體。

圖2 VH和VHH 比較

3 納米抗體的生化特性

（1）免疫原性弱。免疫原性與分子量及化學(xué)結(jié)構(gòu)等有關(guān)，分子量越小免疫原性越小。由于納米抗體的分子量只有常規(guī)抗體的1/10，只有一個(gè)結(jié)構(gòu)域，因此刺激機(jī)體形成特異性抗體或是引起體液和細(xì)胞免疫應(yīng)答機(jī)率大大降低。同時(shí)，納米抗體無Fc段，避免了Fc引起的補(bǔ)體反應(yīng)，對(duì)人體免疫原性很低，與人的生物相容性較好。但也有研究表明納米抗體作為藥物長(zhǎng)期反復(fù)使用會(huì)增加免疫原性，影響治療。無論如何，相比于傳統(tǒng)抗體，納米抗體在免疫原性方面表現(xiàn)的更弱。

（2）可溶性高、耐受性強(qiáng)。納米抗體的FR2中四個(gè)位點(diǎn)的突變，使自身的溶解性增加，成藥性更好。納米抗體內(nèi)部的二硫鍵使其抗熱性和耐酸堿能力變得極強(qiáng)。常規(guī)單克隆抗體穩(wěn)定性差，容易出現(xiàn)聚集現(xiàn)象，并發(fā)生不可逆的熱聚合。而納米抗體在高溫環(huán)境中長(zhǎng)期放置仍然具有生物活性，并且在強(qiáng)變性劑條件下也表現(xiàn)出較高的耐受性。

（3）組織滲透性強(qiáng)。僅有15kD的納米抗體能夠穿透血腦屏障，為大腦中疾病的研究及治療提供新的方法。納米抗體能夠很容易從腎小球?yàn)V過，導(dǎo)致其很快從血清中被清除，半衰期變短。高滲透性的納米抗體可進(jìn)入致密的組織，而多余未結(jié)合的納米抗體很快被清除，這有利于疾病的診斷。此外，納米抗體也適合作為胞內(nèi)抗體靶向胞內(nèi)乃至核內(nèi)蛋白。一種特殊的胞內(nèi)抗體Chromobody，結(jié)構(gòu)為納米抗體與熒光蛋白融合，可以用于監(jiān)測(cè)胞內(nèi)生化過程。

（4）表達(dá)高效、純化簡(jiǎn)單。納米抗體結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，適合于原核和各種真核表達(dá)系統(tǒng)進(jìn)行高效表達(dá)。重組納米抗體通常在E. coli中的表達(dá)量為5-10 mg/L。在酵母和真菌中產(chǎn)量更高，從1 L振蕩培養(yǎng)的酵母菌中培養(yǎng)基能產(chǎn)出100 mg蛋白。納米抗體研發(fā)巨頭Ablynx公司（已被賽諾菲收購）利用酵母反應(yīng)器釀造納米抗體的產(chǎn)量可達(dá)到0.5g/L。不同抗體由于其序列差異表達(dá)產(chǎn)量的差異也較大。其特點(diǎn)表現(xiàn)為：A. 當(dāng)VHH與常規(guī)VH相似時(shí)，VHH的表達(dá)量在酵母中的表達(dá)量會(huì)下降；B. 當(dāng)VHH的C端形成二硫鍵時(shí)，VHH的表達(dá)量會(huì)下降；C. 含有N端糖基化位點(diǎn)的序列，在酵母中的表達(dá)量會(huì)顯著提高。納米抗體生產(chǎn)價(jià)格相對(duì)低廉，可大規(guī)模生產(chǎn)用于開發(fā)治療性抗體藥物、診斷試劑、親和純化基質(zhì)和科學(xué)研究等領(lǐng)域。

納米抗體可用多種方式進(jìn)行純化，并且純化工藝簡(jiǎn)單方便。利用酵母培養(yǎng)物上清液純化的納米抗體純度可達(dá)到80-90%。細(xì)菌提取物通過簡(jiǎn)單的滲透壓沖擊，純化的納米抗體的純度能夠滿足酶聯(lián)免疫吸附法 (Enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)和蛋白質(zhì)印跡法的使用標(biāo)準(zhǔn)。利用C末端His6-tag通過Ni-NTA柱提純，可以獲得純度將近80%的納米抗體。如果需要進(jìn)一步純化，則可以通過離子交換或凝膠過濾層析等方法，可以大大提高純度。

（5）改造容易。納米抗體通常是經(jīng)過基因工程的方法從駱駝血液中克隆出VHH基因，再利用原核或真核細(xì)胞進(jìn)行表達(dá)獲得。因此，人們?nèi)菀讓?duì)現(xiàn)有的納米抗體進(jìn)行修飾或?qū)ο鄳?yīng)的VHH基因進(jìn)行改造。納米抗體是理想的多價(jià)和多特異性抗體的構(gòu)建單元，可通過短小的鏈接序列（linker）聚合在一起轉(zhuǎn)換成多價(jià)或多特異的形式。多價(jià)抗體比單價(jià)抗體具有更高的抗原親和力，多特異性抗體比單價(jià)抗體具有更高的抗原識(shí)別能力。此外，由于是單域抗體，能夠很容易與其他分子偶聯(lián)，如連接放射性同位素、連接毒素制備Immunotoxin等；或是通過基因工程技術(shù)與其他結(jié)構(gòu)形成新的融合分子，如能延長(zhǎng)半衰期的物質(zhì)酶、抗菌肽或是顯影物等

納米抗體作為一種嚴(yán)格的完整單體，其特殊的結(jié)構(gòu)特征和性質(zhì)賦予了其一些其它常規(guī)抗體或抗體片段所不具有的特性。但是納米抗體的臨床安全性問題，主要包括駝源的Nb在人體內(nèi)是否會(huì)產(chǎn)生免疫應(yīng)答，以及腎小球?yàn)V過導(dǎo)致載體核素或藥物誘發(fā)腎臟毒性等問題，關(guān)系到能否大規(guī)模用于腫瘤的診斷與治療。

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納米抗體研發(fā)現(xiàn)狀

當(dāng)前，首個(gè)納米抗體藥物Caplacizumab，由Ablynx（該公司于2018年1月被賽諾菲收購）研發(fā)，已于2018年8月31日獲歐洲藥物管理局（EMA）批準(zhǔn)上市，后于2019年2月6日獲美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局（FDA）批準(zhǔn)上市，商品名為Cablivi®。用于治療獲得性血栓性血小板減少性紫癜（aTTP）的成人患者。由于市場(chǎng)上并無該疾病的治療藥物，caplacizumab成為同類第一的藥物，2009年獲得孤兒藥資格。除此，還有多個(gè)納米抗體進(jìn)入到臨床研究階段。分布在腫瘤、神經(jīng)系統(tǒng)疾病、感染性疾病、皮膚病、免疫系統(tǒng)疾病等多種疾病領(lǐng)域。但有部分藥物已暫?；蛲Ｖ归_發(fā)。

相比于傳統(tǒng)抗體，納米抗體克服了開發(fā)周期長(zhǎng)，穩(wěn)定性較低，保存條件苛刻等缺陷，逐漸成為新一代治療性生物醫(yī)藥與臨床診斷試劑中的新興力量。

參考資料：

1.Hamers-Casterman, C., T. Atarhouch, S. Muyldermans, G. Robinson, C. Hamers, E. B. Songa, N. Bendahman, and R. Hamers. 1993. Naturally occurring antibodies devoid of light chains. Nature 363:446-448.

2.Muyldermans, S., T. N. Baral, V. C. Retamozzo, P. De Baetselier, E. De Genst, J. Kinne, H. Leonhardt, S. Magez, V. K. Nguyen, H. Revets, U. Rothbauer, B. Stijlemans, S. Tillib, U. Wernery, L. Wyns, G. Hassanzadeh-Ghassabeh, and D. Saerens. 2009. Camelid immunoglobulins and nanobody technology. Vet Immunol Immunopathol 128:178-183.

3.HARMSEN M M, RUULS R C, NIJMAN I J, et al. Llama heavychain V regions consist of at least four distinct subfamilies revealing novel sequence features[J]. Mol Immunol, 2000, 37(10):579-590. DOI:10.1016/s0161-5890(00)00081-x.

4.https://www.ema.europa.eu/en/documents/product-information/cablivi-epar-product-information_en.pdf