三大納米載體系統(tǒng)

與常規(guī)藥物相比，核酸具有很好的優(yōu)勢(shì)。核酸的作用機(jī)制和高特異性為病毒感染，各種癌癥和具有未滿足臨床需求的不可用藥的遺傳疾病提供了可能的治療途徑。而且，從理論上講，基因治療可以達(dá)到持久甚至治愈的效果。然而，由于核酸在體內(nèi)的穩(wěn)定性較低，且細(xì)胞外宿主清除迅速，因此將核酸運(yùn)送到細(xì)胞內(nèi)的活性部位是具有挑戰(zhàn)性的。此外，由于核酸的負(fù)電荷、高分子質(zhì)量和親水性，其透過(guò)細(xì)胞膜的能力很差。為了解決核酸藥物分子本身相關(guān)的挑戰(zhàn)，最重要的是要開(kāi)發(fā)能夠促進(jìn)核酸吸收到靶細(xì)胞的遞送載體系統(tǒng)。這些遞送載體本身需要克服細(xì)胞外和細(xì)胞內(nèi)的屏障，耐受血液中的核酸酶活性，增強(qiáng)和協(xié)助核酸藥物細(xì)胞攝取，并在進(jìn)入細(xì)胞后促進(jìn)核酸藥物內(nèi)體逃逸。

基因遞送策略通常分為病毒和非病毒遞送載體，在過(guò)去的幾十年中逐漸成熟。病毒可用于通過(guò)插入到病毒基因組來(lái)遞送感興趣的基因，然后是細(xì)胞感染和基因表達(dá)。具有高DNA轉(zhuǎn)染效率的病毒，如慢病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒和腺相關(guān)病毒，長(zhǎng)期以來(lái)一直用于治療艾滋病毒、癌癥和肌肉萎縮癥等疾病。盡管病毒基因傳遞系統(tǒng)具有很高的細(xì)胞轉(zhuǎn)染率，但由于現(xiàn)有抗體的快速清除、針對(duì)載體的中和抗體的產(chǎn)生、載體大小有限(通常低于7kb)以及可能的副作用為基因傳遞技術(shù)在生物醫(yī)學(xué)研究和臨床上的發(fā)展留下了廣闊空間。近年來(lái)，人們努力設(shè)計(jì)基于脂類、聚合物、多肽和無(wú)機(jī)化合物的非病毒基因遞送系統(tǒng)。

基于脂質(zhì)的納米顆粒、聚合物納米顆粒和無(wú)機(jī)納米顆粒是最常見(jiàn)的三類非病毒納米載體，被用于核酸藥物遞送（圖1）。本文在這里對(duì)這三類納米載體做一個(gè)簡(jiǎn)要介紹。

圖1. 遞送核酸藥物的納米載體系統(tǒng)

基于脂質(zhì)的納米顆粒

基于脂質(zhì)的納米遞送系統(tǒng)是使用最廣泛的非病毒核酸載體，主要是因?yàn)樗鼈冊(cè)谏硪后w中具有穩(wěn)定的納米結(jié)構(gòu)，并且它們與帶負(fù)電荷的內(nèi)體膜融合，從而能夠有效地遞送核酸。脂類是兩親性分子，含有一個(gè)極性的頭部基團(tuán)、一個(gè)疏水的尾部區(qū)域和兩個(gè)結(jié)構(gòu)域之間的連接物?；谥|(zhì)的納米藥系統(tǒng)通常含有其他脂類成分，如磷脂、膽固醇或聚乙二醇組分等(圖2)。這些納米粒子之間的主要差異取決于它們的脂質(zhì)成分、合成參數(shù)、用于核酸包埋的方法。目前這些遞送系統(tǒng)已經(jīng)被應(yīng)用于治療遺傳性疾病(如囊性纖維化和丙酸血癥)和實(shí)體瘤等。

圖2. 常用脂類的化學(xué)結(jié)構(gòu)

脂質(zhì)體

脂質(zhì)體是由帶有極性頭部基團(tuán)和非極性尾部的磷脂以及穩(wěn)定劑(如膽固醇)組成的，由于其兩親性，它們可以自發(fā)地自組裝成囊泡。陽(yáng)離子脂類和兩性離子通常利用脂類與帶負(fù)電荷的核酸之間的靜電作用來(lái)形成陽(yáng)離子脂質(zhì)體，從而提高包封率。較小的脂質(zhì)體更有可能逃脫吞噬細(xì)胞的攝取(≤100 nm)。然而，納米粒子表面的正電荷可能會(huì)導(dǎo)致血清蛋白的非特異性結(jié)合和免疫刺激，導(dǎo)致中毒。為此，開(kāi)發(fā)了聚乙二醇化陽(yáng)離子脂質(zhì)體作為替代品。脂質(zhì)體的制備有三種典型的方法：薄膜水合、溶劑注射和反相蒸發(fā)。這些方法可以實(shí)現(xiàn)有效的藥物包封率、窄的粒徑分散和長(zhǎng)期的穩(wěn)定性。盡管脂質(zhì)體作為核酸載體有很大的優(yōu)勢(shì)，但它們需要復(fù)雜的生產(chǎn)方法，需使用有機(jī)溶劑，這可能會(huì)不利于其大規(guī)模生產(chǎn)。

脂類納米顆粒 (LNPs)

LNPs(直徑50-100 nm)通常包括可電離和陽(yáng)離子脂質(zhì)、膽固醇、磷脂和聚乙二醇脂，其中可電離脂質(zhì)在保護(hù)核酸免受核酸酶降解方面發(fā)揮主要作用。此外，輔助脂類，如磷脂和膽固醇，可以促進(jìn)制劑穩(wěn)定性和膜融合，大約需要30-40 mol%的輔助脂類才能有效地將siRNA包埋在LNPs中。聚乙二醇脂類由親水性聚乙二醇脂聚合物與疏水性脂質(zhì)錨結(jié)合而成，可以改善循環(huán)半衰期和穩(wěn)定性，防止LNPs清除。低分子量的聚乙二醇脂類可以減少非特異性蛋白質(zhì)的吸附。此外，聚乙二醇脂含量決定了顆粒大小。例如，通過(guò)改變聚乙二醇脂類含量(0.25-5 mol%)可獲得大小從27 nm到117 nm的負(fù)載siRNA 得LNPs，從而獲得80 nm的最佳大小以實(shí)現(xiàn)基因沉默效力。

與脂質(zhì)體相反，LNPs在顆粒核心內(nèi)具有膠束結(jié)構(gòu)。此外，與脂質(zhì)體相比，LNPs表現(xiàn)出更好的動(dòng)力學(xué)穩(wěn)定性和更堅(jiān)硬的形態(tài)。大規(guī)模的商業(yè)制備方法可以獲得更均勻的LNPs?？呻婋x的LNPs在生理pH下具有近中性的電荷，但可電離脂質(zhì)上的胺基在低pH時(shí)變得質(zhì)子化并帶正電荷，從而允許與核酸上帶負(fù)電荷的磷酸基團(tuán)組裝。絡(luò)合后，可以將pH調(diào)節(jié)到中性或生理pH，以便進(jìn)行給藥。體內(nèi)注射后，可電離的LNPs可以從血液中滲出到靶組織。然后LNPs可以吸附到細(xì)胞表面，并通過(guò)內(nèi)吞進(jìn)入細(xì)胞。帶正電荷的可電離脂質(zhì)有助于內(nèi)體逃逸，并與內(nèi)體脂膜上的負(fù)電荷相互作用，從而導(dǎo)致內(nèi)小體不穩(wěn)定，促進(jìn)核酸釋放(圖3)。

圖3. LNPs結(jié)構(gòu)及其在遞送核酸藥物的治療過(guò)程

聚合物納米顆粒

聚合物納米顆粒是使用天然聚合物，如葡聚糖、殼聚糖、環(huán)糊精或合成聚合物制備，從而可以制造出具有不同組成和結(jié)構(gòu)的聚合物納米顆粒。最常見(jiàn)的聚合物納米顆粒形式是納米膠囊和納米球，它們有多個(gè)亞類，如多聚物、聚合體和樹(shù)枝狀大分子。聚合物納米顆粒具有合成和簡(jiǎn)單、結(jié)構(gòu)多樣性、合成可擴(kuò)展性、高轉(zhuǎn)染率、基因免疫原性和良好的生物相容性等優(yōu)點(diǎn)，是最有前途的核酸藥物納米遞送材料之一。

多聚物包含陽(yáng)離子聚合物，例如，PEI、殼聚糖和可生物降解的聚酯，它們通過(guò)靜電相互作用與核酸結(jié)合并凝聚成小而緊密的結(jié)構(gòu)?？s合的過(guò)程是由熵驅(qū)動(dòng)的，當(dāng)陽(yáng)離子聚合物與核酸混合時(shí)，多聚物自發(fā)產(chǎn)生。對(duì)于它們的制備，通常使用相對(duì)于寡核苷酸的過(guò)量陽(yáng)離子聚合物，這會(huì)產(chǎn)生表面帶正電荷的顆粒，并更好地將核酸凝聚成更小尺寸的納米顆粒。核酸被包裹在聚合物基質(zhì)中，并受到聚合物鏈的保護(hù)，這可以立體地阻止核解酶的進(jìn)入。此外，通過(guò)引入疏水元素，例如烷基，以通過(guò)疏水聚集或通過(guò)在顆粒核心內(nèi)加入共價(jià)交聯(lián)劑來(lái)促進(jìn)顆粒形成，可以實(shí)現(xiàn)聚合物的更高的包裝穩(wěn)定性。

聚合體，也稱為聚合囊泡，是由兩親嵌段共聚物通過(guò)疏水作用自組裝而成的。兩親性嵌段共聚物的親水性決定了其自組裝形態(tài)。一般情況下，聚合體的親水性約為35±10%。聚合物的制備方法主要采用脂質(zhì)體得方法，包括直接溶解共聚物、膜復(fù)水、溶劑交換和探頭超聲。通常，由于生物大分子的親水性，各種核酸，如pDNA、ASOs和siRNA，可以很好地被包裹到聚合物囊泡的內(nèi)部水核中。由ABC三嵌段共聚物形成的具有不對(duì)稱膜的聚合體被用來(lái)增加內(nèi)水核的體積，改善核酸包裹性。

樹(shù)枝狀大分子已通過(guò)發(fā)散或收斂方法在反應(yīng)步驟的迭代序列中合成。每一個(gè)連續(xù)的反應(yīng)步驟都會(huì)導(dǎo)致額外的一代分支，重復(fù)循環(huán)的數(shù)量被定義為樹(shù)枝狀大分子的生成。樹(shù)枝狀大分子的質(zhì)量和大小可以通過(guò)調(diào)節(jié)樹(shù)枝狀大分子的代數(shù)來(lái)控制，而樹(shù)枝狀大分子的表面可以很容易地通過(guò)不同分子與反應(yīng)端的偶聯(lián)來(lái)功能化，這使得它們?cè)诨蜻f送應(yīng)用中具有吸引力。一些樹(shù)枝狀大分子，如PAMAM、聚丙烯亞胺和PLL，具有明確數(shù)量的正電胺基基團(tuán)，允許通過(guò)離子相互作用連接核酸。例如，由miRNAs的三股螺旋與PAMAM G5樹(shù)枝狀大分子絡(luò)合形成的RNA納米顆粒創(chuàng)建了一種分支海綿狀納米結(jié)構(gòu)，可用于調(diào)節(jié)乳腺腫瘤微環(huán)境中的關(guān)鍵遺傳驅(qū)動(dòng)因素。

對(duì)于聚合物和樹(shù)枝狀大分子，可以將親水性聚合物如聚乙二醇鏈連接到納米顆粒表面，以提高血清的穩(wěn)定性和生物相容性。對(duì)于所有類型的聚合物納米顆粒，靶向部分(包括抗體、轉(zhuǎn)鐵蛋白、葉酸和糖苷部分)附著到納米顆粒表面，通過(guò)靶向部分和靶細(xì)胞表面的分子之間的相互作用來(lái)增加細(xì)胞攝取和靶細(xì)胞特異性。通過(guò)將具有未質(zhì)子化胺基的部分，例如，PEI、殼聚糖，結(jié)合到聚合物納米顆粒中，質(zhì)子海綿效應(yīng)可能會(huì)引起內(nèi)膜腫脹和破裂，從而促進(jìn)內(nèi)膜逃逸。

無(wú)機(jī)納米顆粒

無(wú)機(jī)納米顆粒已經(jīng)被研究用于核酸遞送和成像，包括金納米顆粒、二氧化硅納米顆粒和氧化鐵納米顆粒。它們可以被設(shè)計(jì)成特定的尺寸、結(jié)構(gòu)和幾何形狀。在無(wú)機(jī)納米粒子中，金和氧化鐵納米粒子通常被認(rèn)為是無(wú)毒的納米材料。

金納米顆粒

金納米粒子具有獨(dú)特的光學(xué)特性、合成簡(jiǎn)單和表面功能化，可通過(guò)共價(jià)或非共價(jià)綴合與核酸選擇性協(xié)同修飾。核酸鏈通過(guò)硫醇基團(tuán)共價(jià)連接到金納米顆粒核心上(通常為13-15 nm)。這一策略可用于DNA和siRNA，它們可以直接連接到金核或聚合物修飾的金核上。金納米顆粒表面可以通過(guò)交替的陰離子核酸和聚陽(yáng)離子層(如PEI或PAMAM)以及通過(guò)添加靶向配體來(lái)包封，從而實(shí)現(xiàn)納米顆粒與細(xì)胞表面受體的特定相互作用和結(jié)合。然而需要考慮配體的長(zhǎng)度、密度、疏水性和親和力，并對(duì)其進(jìn)行優(yōu)化以有效地靶向納米顆粒。

二氧化硅納米顆粒

二氧化硅納米顆粒(直徑100-250 nm)由于其良好的生物相容性和可調(diào)性而被用于核酸遞送。通常，核酸分子通過(guò)弱的非共價(jià)相互作用被裝載到二氧化硅納米顆粒中?？椎拇笮『捅砻婀倌芑潭葘?duì)負(fù)載量和核酸釋放率起著至關(guān)重要的作用。具有小孔的二氧化硅納米顆?？梢詾樾》肿雍怂崽峁┛烧{(diào)的釋放速率，而較大的孔可以提供更高的負(fù)載能力和更快的釋放速率。例如，小孔(2.5-5 nm)的二氧化硅納米顆粒適合于傳遞小的siRNA，而大孔(15 nm以上)的二氧化硅納米顆粒適合于負(fù)載大的pDNA40。二氧化硅納米顆粒的負(fù)電荷表面可以共價(jià)修飾為陽(yáng)離子表面，從而極大地影響藥物裝載、蛋白質(zhì)吸附和釋放速率。通過(guò)添加不同類型的陽(yáng)離子大分子，包括PEI、樹(shù)枝狀大分子和脂類，已經(jīng)被用來(lái)修飾二氧化硅納米顆粒表面以吸附和傳遞核酸。

氧化鐵納米顆粒

氧化鐵納米顆粒(由Fe3O4或Fe2O3組成)具有一定尺寸的超順磁性，作為輸送載體和基于熱的療法顯示了成功的效果。這些傳遞系統(tǒng)中的大多數(shù)依賴于表面工程的陽(yáng)離子氧化鐵納米顆粒，這些納米顆粒與陰離子核酸藥物靜電相互作用。例如，50-100 nm的脂類包裹的氧化鐵納米顆粒顯示出最佳的siRNA遞送活性。

小編總結(jié)

基于核酸的療法正在給制藥領(lǐng)域帶來(lái)革命性的變化，因?yàn)樗鼈兛梢葬槍?duì)疾病的遺傳基因，而不是下游的蛋白質(zhì)，這為許多棘手的疾病提供長(zhǎng)期甚至潛在的治愈可能。然而核酸藥物本身在體內(nèi)的穩(wěn)定性較低，且易被迅速清除。用于核酸輸送的納米材料為解決這些難點(diǎn)提供了可能。由于它們具有物理化學(xué)性質(zhì)的可調(diào)性，它們可以很容易地與任何類型的生物分子結(jié)合，用于選擇性的靶向。目前ASOs、mRNA、siRNA等核酸療法已被廣泛用于調(diào)節(jié)DNA或RNA的表達(dá)，基因療法與納米級(jí)遞送系統(tǒng)相結(jié)合，顯著得拓寬了這些分子的治療和生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用，包括生物分析、基因沉默、蛋白質(zhì)替代和疫苗等方面。

參考文獻(xiàn)

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