論文：16種中草藥提取物對(duì)2株草魚(yú)致病菌的體外抑殺菌作用

       16種中草藥提取物對(duì)2株草魚(yú)致病菌的體外抑殺菌作用

李赫，胡宗云，張健，宋文華，富麗靜

（遼寧省淡水水產(chǎn)科學(xué)研究院，遼寧省水生動(dòng)物病害防治重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，遼寧 遼陽(yáng) 111000）

草魚(yú)肉質(zhì)細(xì)嫩、營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高，倍受人們的青睞，已成為池塘高密度集約化養(yǎng)殖的主要種類之一。但是，由于養(yǎng)殖密度過(guò)高、水體環(huán)境惡化，病害越來(lái)越嚴(yán)重，給草魚(yú)養(yǎng)殖業(yè)帶來(lái)了十分巨大的損失。而長(zhǎng)期大量使用抗生素會(huì)出現(xiàn)耐藥菌株和變異株，有效防治更加困難。中草藥是天然藥物，資源豐富，安全性高、毒副作用少，殘留低、不易引起藥源性疾病和產(chǎn)生耐藥性，對(duì)環(huán)境污染少[1,2]；中草藥還有促進(jìn)生長(zhǎng)、調(diào)節(jié)免疫力和提高機(jī)體抗病力等作用[3,4]。金珊等[5]研究了中草藥對(duì)海水養(yǎng)殖鱸病原菌的抑菌效果；李茜等[6]試驗(yàn)了23種中草藥及復(fù)方對(duì)鯽腸道3種細(xì)菌的體外抑菌效果；陶健等[7]研究了21種、陳霞等[8]研究了47種中草藥及復(fù)方制劑對(duì)嗜水氣單胞菌的體外抑菌效果，都證明中草藥具有良好的抗菌抑菌作用。本試驗(yàn)研究了16種中草藥對(duì)2株草魚(yú)致病性細(xì)菌的體外抑菌效果，從中篩選出對(duì)兩種致病菌有較好抑菌作用的藥物，為防治該致病菌引起的疾病提供了依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種

實(shí)驗(yàn)用菌株由本實(shí)驗(yàn)室從遼寧地區(qū)池塘患病草魚(yú)內(nèi)臟中分離、保存，分別編號(hào)為H4和H35?；貧w感染實(shí)驗(yàn)證實(shí)該菌株為致病菌，致病性較強(qiáng)。生理生化試驗(yàn)和16S rDNA序列分析證明，H4為嗜水氣單胞菌Aeromonas hydrophila，H35為類志賀鄰單胞菌Plesiomonas Shigelloides。

1.1.2 培養(yǎng)基

液體培養(yǎng)基配方為：蛋白胨10g、牛肉膏3g、鹽5g、蒸餾水 1 000mL，pH 調(diào)至 7.0～7.2。固體培養(yǎng)基為每1 000mL液體培養(yǎng)基加入18 g瓊脂。

1.1.3 中草藥

實(shí)驗(yàn)所用的16種中草藥為地膚子、小茴香、茯苓、蛇床子、牡丹皮、黃芪、陳皮、藿香、豬苓、高良姜、黃柏、苦參、昆布、肉桂、姜黃和丁香，購(gòu)自遼陽(yáng)市博大藥房。

1.2 方法

1.2.1 藥液的制備

將16種中草藥分別放于60℃恒溫干燥箱中烘至恒重后粉碎，80目篩過(guò)濾備用。稱取50g中草藥，加500mL蒸餾水，室溫浸泡24h后，文火煎煮30 min，濾出煎液，重復(fù)三次，合并濾液，濃縮至生藥含量1g/mL，121℃滅菌20min，置4℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/span>

1.2.2 抑菌效果的測(cè)定

采用瓊脂擴(kuò)散法測(cè)定抑菌效果：用打孔機(jī)將1#定性濾紙打成直徑為6mm的圓形紙片，經(jīng)121℃滅菌20min后，分別浸入各中藥水提液中，待其干燥后，在無(wú)菌條件下平鋪在涂有菌液的固體培養(yǎng)基平板上；對(duì)照組用無(wú)菌蒸餾水浸泡紙片。28℃下培養(yǎng)24h后，測(cè)定抑菌圈直徑。

結(jié)果判定：抑菌圈直徑≥20mm為極敏，用“+++”表示；15～19mm 為高敏，用“++”表示；10～14mm為中敏，用“+”表示；＜10mm以下為低敏，用“-”表示[9]。

1.2.3 菌懸液的制備

挑取適量?jī)龈删N，接種于液體培養(yǎng)基中，置于28℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24h，以接種環(huán)蘸取菌液在瓊脂平板上劃線，培養(yǎng)24h，挑取單個(gè)菌落接種于固體培養(yǎng)基上，28℃下培養(yǎng)18h后，用無(wú)菌生理鹽水將菌體沖洗下來(lái)。使用麥?zhǔn)媳葷岱?，將菌液濃度稀釋?×107CFU/mL，置于4℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/span>

1.2.4 最小抑菌質(zhì)量濃度（MIC）測(cè)定

采用二倍稀釋法[10]測(cè)定16種中草藥藥液對(duì)兩株細(xì)菌的最小抑菌質(zhì)量濃度（MIC）。每種中草藥取滅菌試管7支，分別編號(hào)；第1號(hào)試管內(nèi)加入2.5mL藥物原液，2～7號(hào)試管每支加2.5mL液體培養(yǎng)基，2號(hào)管加2.5mL藥液，充分混勻后吸取2.5mL至3號(hào)試管中，依次倍比稀釋至7號(hào)試管，棄去2.5mL。1～7號(hào)試管均加入100μL菌液，搖勻，每種中草藥重復(fù)3次；另準(zhǔn)備3支試管作為對(duì)照管，在其中加入2.5mL液體培養(yǎng)基和100μL菌液。將所有試管放置于28℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h后，觀肉眼察結(jié)果。藥物最低濃度管中無(wú)細(xì)菌生長(zhǎng)者即為最小抑菌質(zhì)量濃度（Minimal InhibitoryConcentration，MIC）。

1.2.5 最小殺菌質(zhì)量濃度（MBC）測(cè)定

在最小抑菌質(zhì)量濃度試驗(yàn)基礎(chǔ)上，從無(wú)明顯細(xì)菌生長(zhǎng)的試管中用涂布棒蘸取營(yíng)養(yǎng)液，涂布于瓊脂平板培養(yǎng)基，放于28℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h后觀察結(jié)果。以平板培養(yǎng)基上無(wú)菌落生長(zhǎng)的最低藥物濃度作為最小殺菌質(zhì)量濃度（Minimal Bactericidal Concentration，MBC）。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同中草藥的抑菌效果比較

16種中草藥對(duì)兩株細(xì)菌的抑菌活性各不相同（表1）。其中，茯苓、昆布和姜黃對(duì)H4的抑菌圈明顯，直徑分別為（23.86±0.22）mm、（21.73±0.71）mm、（20.73±0.33）mm，抑菌作用強(qiáng)（＋＋＋）；小茴香、肉桂對(duì)H4抑菌作用中等（＋＋）；蛇床子、丁香對(duì)H4抑菌作用低（＋）；地膚子等9種中草藥對(duì)H4無(wú)抑菌作用（-）。黃芪、丁香對(duì)H35抑菌圈明顯，直徑分別為（17.66±0.35）mm、（18.93±0.37）mm，抑菌作用中等（＋＋）；牡丹皮、肉桂對(duì)H35抑菌作用低（＋）；地膚子等10種中草藥對(duì)H35無(wú)抑菌作用（-）。

表1 16種中草藥對(duì)H4和H35的抑菌效果Tab.1 Antibacterial effect of 16 kinds of Chinese herbal medicine on H4 and H35

2.2 不同中草藥對(duì)2株細(xì)菌的最小抑菌質(zhì)量濃度和最小殺菌質(zhì)量濃度

16種中草藥有效成分對(duì)2株細(xì)菌的MIC和MBC的測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表2。茯苓對(duì)H4的MIC和MBC最小，MIC 為 15.63mg/mL，MBC 為 31.25mg/mL；小茴香、昆布、姜黃次之，其MIC均為31.25mg/mL，其MBC分別為125mg/mL、125mg/mL和62.5mg/mL；蛇床子、肉桂、丁香、豬苓、黃柏對(duì)H4也有一定的抑菌作用，其MIC分別為125mg/mL、62.5mg/mL、125mg/mL、250mg/mL和250mg/mL，其MBC分別為250mg/mL、62.5mg/mL、125mg/mL、500mg/mL 和 500mg/mL；地膚子、牡丹皮、黃芪、陳皮、藿香、高良姜、苦參對(duì)H4的MIC和MBC最大，其MIC和MBC均大于1 000 mg/mL。

丁香對(duì)H35的MIC和MBC最小，MIC和MBC均為31.25mg/mL；黃芪、牡丹皮、陳皮、肉桂、高良姜次之，MIC 分別為 62.5mg/mL、125mg/mL、125mg/mL、250mg/mL 和 125mg/mL，MBC 分別為 125mg/mL、125mg/mL、250mg/mL、500mg/mL和 125mg/mL；地膚子、小茴香、茯苓、蛇床子、藿香、豬苓、黃柏、苦參、昆布、姜黃對(duì)H35的MIC和MBC最大，其MIC和MBC均大于1 000mg/mL。

表2 16種中草藥對(duì)H4和H35的MIC和MBCTab.2 MIC and MBC of 16 kinds of Chinese herbal medicine on H4 and H35

3 討論

類志賀鄰單胞菌是一種人畜共患菌，不僅能引起人類菌血癥、腸胃炎、腦膜炎等[11,12]，也是魚(yú)類的一種潛在致病菌，對(duì)羅氏沼蝦、斑點(diǎn)叉尾等[13,14]多種水生動(dòng)物均有致病性。類志賀鄰單胞菌對(duì)草魚(yú)的感染死亡報(bào)道較少。胡錢(qián)東[15]等首次報(bào)道了志賀鄰單胞菌是草魚(yú)肌肉糜爛病的致病菌，對(duì)草魚(yú)有致病性。張新艷等[16]報(bào)道了志賀鄰單胞菌引起草魚(yú)的發(fā)病率可達(dá)50%以上，死亡率為10%～15%。

嗜水氣單胞菌是我國(guó)流行比較廣泛的一種人畜共患的條件致病菌，是淡水魚(yú)類爆發(fā)性傳染病的主要病原菌之一，給水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失[17]。嗜水氣單胞菌對(duì)草魚(yú)具有很強(qiáng)的致病性，主要引起細(xì)菌性敗血癥，以全身出血為主要癥狀，同時(shí)感染或混合感染嗜水氣單胞菌也可引起腸炎和爛鰓癥狀[18]。草魚(yú)細(xì)菌性敗血癥是引起經(jīng)濟(jì)損失最為嚴(yán)重的病害之一。

目前，在漁業(yè)生產(chǎn)中，主要使用抗生素防治細(xì)菌性疾病，但濫用、錯(cuò)用和不規(guī)范使用抗生素，不僅導(dǎo)致嚴(yán)重的藥物殘留，威脅人類健康，還會(huì)增加耐藥菌株，增強(qiáng)耐藥性[19]，因而中草藥的應(yīng)用日益受到關(guān)注。中草藥在水產(chǎn)動(dòng)物疾病防治中的應(yīng)用已有報(bào)道。汪黎虹等[20]測(cè)定了10種中藥對(duì)18株鰻鱺（Anguilla japonica Temminck et Schlegel）常見(jiàn)致病菌的抑制效果，發(fā)現(xiàn)10種中藥對(duì)除B12以外的17株養(yǎng)殖鰻鱺主要致病菌均有一定的抑制作用。張海賓等[21]選取12種中草藥對(duì)嗜水氣單胞菌的敏感性試驗(yàn)表明，五倍子、大黃、烏梅、黃芩、黃連的抑菌圈直徑大，抑菌濃度低，藥效持久。

本試驗(yàn)測(cè)定了16種中草藥對(duì)2株草魚(yú)致病菌的抑殺菌效果。結(jié)果表明，對(duì)嗜水氣單胞菌（H4）的抑菌效果由高到低依次為：茯苓＞小茴香、昆布、姜黃＞肉桂＞蛇床子、丁香＞豬苓、黃柏；對(duì)類志賀鄰單胞菌（H35）的抑菌效果由高到低依次為：丁香＞黃芪＞牡丹皮、陳皮、肉桂、高良姜。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，姜黃對(duì)嗜水氣單胞菌的抑菌圈直徑為（20.73±0.33）mm，這與喻鵬飛等[22]報(bào)道的結(jié)果相一致，說(shuō)明姜黃對(duì)嗜水氣單胞菌有較好的抑菌效果；丁香和黃柏對(duì)嗜水氣單胞菌的MIC分別為125mg/mL和250mg/mL，這與張文青等[23]（50mg/mL和100mg/mL）的報(bào)道不同。賴曉健等[24]研究發(fā)現(xiàn)，丁香對(duì)太平洋雙色鰻鱺Anguilla bicolor pacifica致病性類志賀鄰單胞菌的抑菌效果最好，其MIC為4mg/mL，而本試驗(yàn)中丁香對(duì)類志賀鄰單胞菌的MIC為31.25mg/mL，出現(xiàn)上述差異可能有兩個(gè)原因，一是中草藥產(chǎn)地不同，二是細(xì)菌來(lái)源不同。本試驗(yàn)結(jié)果表明，可以用中草藥防治由該2株細(xì)菌引起的水產(chǎn)動(dòng)物疾病，但中草藥在體內(nèi)的抗菌效果與體外并不一致，其有效成分在體內(nèi)和體外發(fā)揮作用的環(huán)境相差較大，體內(nèi)的各種消化液、酶、激素等化學(xué)成分影響很大，所以本試驗(yàn)結(jié)果僅供參考。同種中草藥對(duì)不同菌株的抑制作用也不同，實(shí)際應(yīng)用時(shí)應(yīng)先確定致病菌的種類，再區(qū)別用藥。

綜上所述，茯苓和丁香可以分別作為嗜水氣單胞菌和類志賀鄰單胞菌引起的水產(chǎn)動(dòng)物疾病的有效防治藥物，其次是小茴香、昆布、姜黃、肉桂、蛇床子、丁香、豬苓、黃柏（H4）及黃芪、牡丹皮、陳皮、肉桂、高良姜（H35）。用中草藥防治魚(yú)病時(shí)，可根據(jù)藥物的性質(zhì)，適當(dāng)配伍，發(fā)揮藥物的協(xié)同作用，提高療效。

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