羅非魚加工副產(chǎn)物不同部位硫酸軟骨素的制備、理化性質(zhì)及結(jié)構(gòu)表征

硫酸軟骨素（CS）是一種高度硫酸化的糖胺聚糖，由交替的D-葡萄糖醛酸（GlcA）和N-乙酰氨基半乳糖（GalNAc）連接的二糖單位組成。相比之下，由于陸地動(dòng)物存在瘋牛病，豬霍亂和口蹄疫等疾病，海洋來(lái)源的CS安全性更高。然而，商品化CS主要是鯊魚來(lái)源，其資源珍稀且價(jià)格昂貴，因此尋找經(jīng)濟(jì)且安全性高的CS新來(lái)源受到學(xué)者們的廣泛關(guān)注。

廣東海洋大學(xué)食品科技學(xué)院，廣東省水產(chǎn)品加工與安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東省海洋生物制品工程實(shí)驗(yàn)室，廣東省海洋食品工程技術(shù)研究中心的左格格、鐘賽意*等以羅非魚副產(chǎn)物不同部位為原料制備CS，并對(duì)其理化性質(zhì)和精細(xì)結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，評(píng)估羅非魚下腳料是否可以作為商品化CS的一個(gè)潛在來(lái)源，旨在為羅非魚副產(chǎn)物的高值化開發(fā)利用提供參考。

1、理化性質(zhì)分析

如表1所示，羅非魚副產(chǎn)物不同部位CS的理化性質(zhì)具有差異性。4 個(gè)部位CS的總糖含量和糖醛酸含量沒有顯著差異。魚頭和魚尾的CS含量、GlcN含量、硫酸基含量沒有顯著差異。其中魚頭部位的CS質(zhì)量分?jǐn)?shù)和提取率最高，分別達(dá)到（90.37±1.77）%和1.02%，可能是CS主要存在于軟骨中；魚尾、魚鰭和魚脊骨CS質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為（83.33±17.88）%、（59.76±1.22）%和（52.01±3.15）%。GlcN質(zhì)量分?jǐn)?shù)依次為魚尾、魚頭、魚鰭、魚脊骨，最高達(dá)（19.28±1.62）%，最低為（2.49±0.62）%。4 個(gè)部位CS的硫酸基質(zhì)量分?jǐn)?shù)依次為魚頭（22.89±0.11）%、魚尾（22.72±2.92）%、魚鰭（18.34±0.42）%、魚脊骨（12.56±0.28）%，差異明顯。4 個(gè)部位CS的蛋白質(zhì)含量較低，說(shuō)明三氯乙酸除蛋白效果較好。

2、結(jié)構(gòu)表征

紫外波長(zhǎng)掃描光譜

如圖1所示，羅非魚副產(chǎn)物不同部位CS和CS標(biāo)準(zhǔn)品都在190～200 nm之間具有糖類特征吸收峰，且峰形均較窄、尖銳、無(wú)其他雜峰。其中魚頭和魚脊骨CS在260 nm波長(zhǎng)處有微弱的吸收峰，說(shuō)明含有少量的核酸。4 個(gè)部位CS在280 nm波長(zhǎng)處都沒有蛋白質(zhì)的吸收峰，表明純度較好。

醋酸纖維膜電泳

如圖2所示，CS-C和CS-A的結(jié)構(gòu)相似，但CS-C的硫酸化程度和電荷密度較高，因此遷移率表現(xiàn)比CS-A快。羅非魚副產(chǎn)物不同部位CS的電泳條帶單一、較窄，說(shuō)明不含其他糖胺聚糖且電荷均一。4 個(gè)樣品的遷移率與CS標(biāo)準(zhǔn)品接近，均含有不同比例的CS-A和CS-C。

傅里葉變化紅外光譜分析

如圖3所示，4 個(gè)部位CS在4 000～1 300 cm-1范圍內(nèi)無(wú)明顯區(qū)別，而在1 300～400 cm-1指紋區(qū)域內(nèi)有細(xì)微差別。魚頭和魚尾CS紅外圖譜在指紋區(qū)與CS-C標(biāo)準(zhǔn)品相近，而魚脊骨和魚鰭CS與CS-A標(biāo)準(zhǔn)品相似。如表2所示，4 個(gè)樣品CS相同之處在于：在3 400 cm-1附近處由O—H伸縮振動(dòng)引起，說(shuō)明存在氫鍵，且峰形均較寬；2 900 cm-1附近有糖類物質(zhì)的特征吸收峰；1 640 cm-1和1 550 cm-1附近有—NHCOCH3—的C＝O伸縮振動(dòng)和N—H變角振動(dòng)，屬于酰胺I吸收帶；1 420 cm-1附近存在羧基的C＝O伸縮振動(dòng)；1 370 cm-1附近有以GlcA形式存在的O—H變角振動(dòng)；1 240 cm-1附近存在硫酸基；1 040 cm-1和920 cm-1附近存在吡喃糖伸縮振動(dòng)，說(shuō)明4 個(gè)部位CS都存在糖環(huán)、乙酰氨基、硫酸基、羥基和羧基等官能團(tuán)，具有CS的基本結(jié)構(gòu)。

分子質(zhì)量分析

如圖4所示，羅非魚下腳料不同部位CS的出峰時(shí)間和CS標(biāo)準(zhǔn)品一致，其中倒峰是溶劑NaNO3的峰，相比較而言樣品CS的峰形對(duì)稱性較差且有雜峰，表明樣品中含有小分子雜質(zhì)。將保留時(shí)間代入不同分子質(zhì)量葡聚糖所得的線性回歸方程，結(jié)果如表3所示。

CS的相對(duì)分子質(zhì)量一般在5 000～50 000范圍內(nèi)，羅非魚副產(chǎn)物不同部位CS的分子質(zhì)量屬于CS類。比較發(fā)現(xiàn)，鯊魚來(lái)源CS-C標(biāo)準(zhǔn)品的mn、mw和mz均顯著高于牛軟骨來(lái)源的CS-A標(biāo)準(zhǔn)品。魚脊骨和魚鰭CS的mn較接近，分別為18 402和19 481，接近但均低于CS-A。而魚頭和魚尾CS的mn介于CS-A和CS-C之間，分別為51 422和76 371。魚頭CS的mw和mz都高于其他3 個(gè)部位CS，顯著低于CS-C標(biāo)準(zhǔn)品。

單糖組成分析

采用PMP衍生法，以CS-A和CS-C為參照，對(duì)羅非魚副產(chǎn)物不同部位CS進(jìn)行單糖組成測(cè)定，色譜圖如圖5所示，分析結(jié)果如表4所示。

4 個(gè)部位CS和標(biāo)準(zhǔn)品的單糖種類相似，主要含有GlcA、Glc、GalN，以及少量的GlcN、GalA、GlcNA、Gal、Xyl、Ara。魚頭CS不含有GalA，魚尾CS含有少量的Man。不同部位CS在13 min都在出現(xiàn)了與標(biāo)準(zhǔn)品出峰時(shí)間不匹配的未知峰，可能是未降解的寡糖片段，這與分子質(zhì)量分析結(jié)果一致。

二糖組成分析

將羅非魚副產(chǎn)物不同部位CS用硫酸軟骨素酶降解，利用強(qiáng)陰離子交換-HPLC對(duì)酶解產(chǎn)物進(jìn)行分析，色譜圖如圖6所示。CS-A和CS-C的硫酸基團(tuán)位置和數(shù)量不同，CS-A中Δdi4S比Δdi6S多，而CSC相反。如表5所示，4 個(gè)部位CS均不含三硫酸化二糖。其中魚頭CS不含有二硫化二糖，Δdi6S（46.10%）比Δdi4S（41.01%）含量高，屬于CS-C。魚尾也是CS-C，與魚頭不同的是還含有0.68%二硫酸二糖（Δdi2,6S）。鯊魚CS主要由單硫酸二糖Δdi6S（40.8%）和Δdi4S（34.9%）組成，從羅非魚頭和魚尾提取的CS與鯊魚CS的二糖組成相似。Δdi4,6S（1.21%）只在魚脊骨CS中存在，除此之外還包含Δdi2,4S（0.46%），但Δdi4S（71.86%）含量最高，主要為CS-A。魚鰭CS與魚脊骨CS二糖組成相似，但不含有Δdi4,6S而是含有0.41%的Δdi2,6S二硫化二糖，主要為CS-A。根據(jù)Δdi4S和Δdi6S物質(zhì)的量比（4S/6S）可得出相同結(jié)論，與紅外光譜掃描的結(jié)果一致。硫酸化程度和電荷密度呈正比，4 個(gè)部位CS的電荷密度0.96～0.81不等，其中魚鰭CS電荷密度最高，硫酸根含量最高；其次是魚脊骨CS，最低的是魚尾CS，這與醋酸纖維膜電泳結(jié)果相同。

一

結(jié)論

結(jié)果表明，魚頭、魚尾所含硫酸軟骨素主要為C型（Δdi6S），含量分別為46.10%和41.01%；魚脊骨、魚鰭所含硫酸軟骨素主要為A型（Δdi4S），含量分別為71.86%和69.59%。純度從高到低依次為魚頭90.37%、魚尾83.33%、魚脊骨59.76%、魚鰭52.01%。魚頭、魚脊骨、魚鰭、魚尾硫酸軟骨素的單糖組成主要由不同比例的葡萄糖醛酸、葡萄糖和氨基半乳糖構(gòu)成，mn依次為51 422、18 402、19 481、76 371。不同部位提取的硫酸軟骨素的種類和組成有明顯差異，其中羅非魚頭、魚尾提取的硫酸軟骨素與鯊魚軟骨來(lái)源硫酸軟骨素結(jié)構(gòu)相似，有望作為代替鯊魚硫酸軟骨素的潛在來(lái)源。