論文：鯉春病毒血癥病毒的研究進(jìn)展

        鯉春病毒血癥病毒的研究進(jìn)展

林婧楠，趙景壯，盧彤巖，徐黎明

（1.中國水產(chǎn)科學(xué)研究院黑龍江水產(chǎn)研究所，黑龍江 哈爾濱 150070；2.上海海洋大學(xué)水產(chǎn)與生命學(xué)院，上海 201306）

鯉春病毒血癥病毒屬單股負(fù)鏈RNA病毒目，彈狀病毒科Rhabdoriridae，暫定為水泡性病毒屬Vesiculorius，被類脂囊膜包裹的彈狀病毒[1]。鯉春病毒血癥的潛伏期較短，沒有典型的外部臨床癥狀，容易誤診。目前尚無有效控制該病的方法，一旦出現(xiàn)疑似該病的癥狀，應(yīng)及早確診，隔離感染和帶毒的病魚，截?cái)嗨絺鞑ネ緩郊安稓砜刂啤?/span>

1 病原生物學(xué)特征

CSVV病毒粒子在15%～60%的蔗糖溶液中浮力密度為1.16g/mL[2,3]，在5%～25%的蔗糖梯度中沉降系數(shù)為38～40S[4]。外界環(huán)境的改變影響病毒的感染性，對酸（在pH3時(shí)30min，侵染率1%）、堿（在pH11時(shí)，侵染率50%～70%，pH7～10時(shí)最為穩(wěn)定）、熱（56℃，30min）、脂溶劑以及乙醚最為敏感，其他化學(xué)試劑，如2%NaOH、500mg/L含氯消毒劑、0.01%碘，在特定濃度和作用時(shí)間可使病毒失活，可用于養(yǎng)殖消毒。血清可以保護(hù)病毒的侵染力，實(shí)驗(yàn)室常用2%血清培養(yǎng)液保護(hù)病毒。含有血清時(shí)，經(jīng)過4次反復(fù)凍融，侵染率在90%左右，而缺乏血清時(shí)，侵染率僅為5%左右。冷凍真空干燥可長期保存病毒[5]。

2 基因結(jié)構(gòu)特征

CSVV粒子為典型的彈狀結(jié)構(gòu)，一端圓弧形，另一端平坦，長90～180nm，寬60～90nm[5-7]。其基因組全長為 11 019bp[8]，由非翻譯前導(dǎo)（Leader）區(qū)、基因區(qū)、基因間連接區(qū)及非轉(zhuǎn)錄拖尾（Trailer）區(qū)4個(gè)主要部分構(gòu)成（圖1）。

基因前導(dǎo)區(qū)有69bp，前19bp可能為啟動(dòng)子，其中50～56bp（GAAAAAT）為前導(dǎo)RNA轉(zhuǎn)錄終止信號，60～64bp（AACAG）為N基因轉(zhuǎn)錄起始信號。

基因區(qū)共包含5個(gè)開放閱讀框（ORFs），編碼5種結(jié)構(gòu)蛋白：核蛋白（Nuclear protein，N）、磷蛋白（Phosphoprotein，P）、基質(zhì)蛋白（Matrixprotein，M）、糖蛋白（Glycoprotein，G）和 RNA 聚合酶（RNA polymerase，L），3’端到 5’端的排列順序?yàn)?N-P-M-G-L。

核蛋白（N）在病毒粒子中含量最多，主要與RNA緊密結(jié)合構(gòu)成直徑約50nm、呈螺旋對稱的核衣殼。該結(jié)構(gòu)蛋白在轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)中起重要的作用[6]。

磷蛋白（P）為核衣殼的組成部分，呈酸性，純化后SVCV的P蛋白在SDS-PAGE中分子量約50kD，高于推算的結(jié)果（35.5kD），其原因可能是P蛋白N端（45～88）存在一個(gè)大的負(fù)電荷結(jié)構(gòu)域[8]。

基質(zhì)蛋白（M）由223個(gè)氨基酸組成，呈磷酸化、高度堿性，構(gòu)成囊膜內(nèi)表面。糖蛋白通過M蛋白與螺旋狀核衣殼相連，共同實(shí)現(xiàn)病毒粒子的裝配、出芽的啟動(dòng)功能。

糖蛋白（G）由509個(gè)氨基酸構(gòu)成，病毒粒子的囊膜表面有長釘狀的糖蛋白突起。成熟的糖蛋白為三聚體囊膜粒子，由3部分構(gòu)成：胞外結(jié)構(gòu)域、跨膜結(jié)構(gòu)域和胞漿結(jié)構(gòu)域，是典型的跨膜蛋白，能選擇性地識(shí)別宿主細(xì)胞受體，促使二者的膜融合，介導(dǎo)病毒內(nèi)吞，使宿主細(xì)胞感染致?。辉诿庖呦到y(tǒng)下，識(shí)別病原，誘導(dǎo)宿主產(chǎn)生中和抗體。糖蛋白含有與免疫相關(guān)的抗原決定簇，對血清學(xué)特征起決定性作用，是當(dāng)前DNA疫苗設(shè)計(jì)研究的熱點(diǎn)。2002年至2004年，劉葒等[9]從養(yǎng)殖的鯉科魚類和觀賞魚中分離出8株CSVV，測定了其G蛋白編碼的基因序列，發(fā)現(xiàn)我國的這8個(gè)分離株與USA株、980451株、980528株和970469株在系統(tǒng)發(fā)育樹上的進(jìn)化方向一致。根據(jù)Stone等[10]對各地分離出的部分CSVV的G蛋白基因序列以及Basic等[11]1994年至2007年收集的22株G蛋白部分核酸序列的分析和系統(tǒng)發(fā)育樹比較，將CSVV的基因型分成Ia、Ib、Ic和Id 4個(gè)亞組，Ia和Id的變異度較高，又將有明顯差別的3個(gè)Id基因組毒株劃分為Id1、Id2及Id3。CSVV中的一個(gè)血清型能與狗魚苗彈狀病毒（Pike fry rhabdovirus,PFRV）產(chǎn)生交叉反應(yīng)。前期研究發(fā)現(xiàn)，中國CSVV的分離株的基因型為Ia[12]。

RNA聚合酶（L）是核衣殼的組成成分，可與N、P蛋白共同組成病毒內(nèi)核衣殼的RNA蛋白復(fù)合物，完成病毒的轉(zhuǎn)錄和復(fù)制。

圖1 鯉春病毒血癥病毒（carp spring virernia virus,CSVV）病毒結(jié)構(gòu)、基因組結(jié)構(gòu)以及連接順序（引自http://viralzone.expasy.org/4657）Fig.1 Structure,genomic and linkage of carp spring virernia virus（CSVV）

在基因間連接區(qū)的G-L基因中存在4bp（CTAT）保守序列，其余基因間存在2bp（CT）保守序列[13]。該調(diào)控區(qū)存在于水泡病毒屬中；G-L基因間不存在類似粒彈狀病毒屬編碼的非結(jié)構(gòu)蛋白（nonstructural protein，NVprotein）基因。該蛋白在病毒復(fù)制過程中起重要作用，這兩點(diǎn)均為區(qū)分粒彈狀病毒屬和水泡性病毒屬的重要標(biāo)志。

拖尾區(qū)有49bp，其中TATG（A）7為L基因轉(zhuǎn)錄終止信號，末端的8個(gè)核苷酸序列（GTCTTCGT）與前導(dǎo)區(qū)末端（ACGAAGAC）呈反向互補(bǔ)，是彈狀病毒基因組及不分段負(fù)鏈RNA病毒的共同特征[8]。

與同屬的其他彈狀病毒相比，CSVV的蛋白序列中L蛋白間的同一性最高，與VSV的L蛋白氨基酸序列同一性達(dá)53.6%[14]；與水皰性口炎病毒（Vesicular Stomatitis Virus，VSV）的M蛋白同一性達(dá)28%，在羧基末端的同一性較低[15]。

3 分類特征

迄今已報(bào)道的魚類彈狀病毒（Fish rhabdovirus）有十幾種，鯉春病毒血癥病毒（CSVV）是其中的一種，此外還包括病毒性出血敗血癥病毒（Viral haemorrhagic septicemia virus，VHSV）、傳染性造血器官壞死病毒 （Infectious hematopoietic necrosis virus，IHNV）、日本牙鲆彈狀病毒（Hirame rhabdovirus，HIRRV）、狗魚苗彈狀病毒、烏鱧彈狀病毒（Snakehead rhabdovirus，SHRV）、彈狀病毒 903/87（Rhabdovirus 903/87,903/87）、鱖彈狀病毒（Mandarin fish Siniperca chuatsi rhabdovirus，SCRV）、胭脂魚彈狀病毒（Chinese sucker rhabdovirus，CSRV）及新近分離出的海鮭彈狀病毒28/97（Sea trout rhabdovirus 28/97，STRV28/97）等[16-19]。

彈狀病毒科包括水泡性病毒屬（Vesiculovirus）、狂犬病毒屬（Lyssavirus）、暫時(shí)熱病毒屬（Ephemerovirus）和粒彈狀病毒屬（諾拉彈狀病毒屬，Novirhabdovirus）。其中粒彈狀病毒屬是國際病毒分類委員會(huì)第7次報(bào)告上設(shè)立的一個(gè)新屬。根據(jù)是否含有編碼非結(jié)構(gòu)蛋白的基因，將傳染性造血器官壞死病毒、病毒性出血敗血癥病毒（viral haemorrhagic septicemia virus，VHSV）、鱧彈狀病毒、牙鲆彈狀病毒歸為粒彈狀病毒屬。而鯉春病毒血癥病毒和狗魚苗彈狀病毒暫定為水泡性病毒。

4 流行情況

鯉春病毒血癥病毒感染的魚類較為廣泛，主要感染鯉科魚類，如錦鯉Cyprinus carpio、草魚Cten opharyngodm idellus、鯽 Carassius auratus、鰱 Hypophthalmichthys molitrix、鳙 Aristichthys nobilis、金魚 Carassius auratus、擬鯉 Rutilus rutilus、圓腹雅羅魚Leuciscus idus和丁鯛Tinca tinca等。此外，自然感染的魚類還有六須鲇Silurus glanis[20]。一齡以上的鯉最易感染患病。在中世紀(jì)，該病在歐洲開始流行，對歐洲各國鯉科魚類養(yǎng)殖業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失[21]，而后向美洲和亞洲等地傳播。我國于2003年首次在天津養(yǎng)殖場的觀賞魚中分離出SVCV[22]。目前，該病已成為全球性魚類的疾病。

該病毒可在13～22℃下生長，最適為17℃。因此，SVC常在水溫15～20℃的春季爆發(fā)，17℃左右發(fā)病率高，水溫超過20℃有所下降，超過22℃不再發(fā)病。

染毒魚、病魚和病死魚是主要的傳染源，以水平傳播為主，垂直傳播次之。水平傳播包括直接接觸傳播和間接傳播，間接傳播包括非生物媒介（水）；生物媒介（水生吸血寄生蟲）以及污物傳播。病毒隨附著污物（糞便、尿液、皮膚黏液和性腺分泌液等）排出體外，4～10℃時(shí)水中和泥中仍具有感染性，可保持4～6周[5,23]，可通過鰓進(jìn)入魚體內(nèi)，在血液中保持11周左右。

5 臨床癥狀及病理變化

5.1 臨床癥狀

行為變化：早期病魚呼吸困難，需氧量高，常聚集在池塘進(jìn)水口附近，食欲減退，行動(dòng)遲緩，對應(yīng)激的反應(yīng)遲鈍，身體平衡力降低；后期病魚萎靡，身體傾斜，常臥于池底[21,24]，嚴(yán)重時(shí)停止游動(dòng)。

臨床癥狀：病魚體表發(fā)黑、眼球突起、鰓絲蒼白、皮膚表面和肌肉有出血點(diǎn)、腹部腫脹、內(nèi)有積水，肛門處拖有一細(xì)長、黏稠、糞便樣的腸黏膜炎癥產(chǎn)物與排泄物的混合產(chǎn)物，常稱之為“假糞”，但不屬于該病的特征性癥狀。

5.2 病理變化

染毒魚最終因體內(nèi)水鹽平衡失調(diào)致死。剖檢病魚發(fā)現(xiàn)，主要以全身性出血、水腫為主要特征癥狀。病毒通常在毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞、造血組織和腎元細(xì)胞等部位增殖。在感染期，肝、腎、脾、鰓、腦髓病毒含量較高，常作為檢驗(yàn)組織，發(fā)病3周后，含量迅速下降消失。血液中病毒滴度不高，但持續(xù)時(shí)間長。肝臟實(shí)質(zhì)組織出現(xiàn)多個(gè)病灶壞死、充血，可見黃疸現(xiàn)象；胰臟組織出現(xiàn)炎癥以及大量壞死病灶；脾臟充血，網(wǎng)狀內(nèi)皮大量增生；腸道嚴(yán)重發(fā)炎，出現(xiàn)卡他性腸炎。

6 檢測技術(shù)

CSVV病毒可在鯉上皮瘤細(xì)胞（EPC）、草魚性腺細(xì)胞（CO）、鳙尾柄細(xì)胞株（FHM）、藍(lán)鰓太陽魚成纖維細(xì)胞（Lepomis macrochirus，BF-2）和虹鱒性腺細(xì)胞（RTG-2）等魚類細(xì)胞株上增殖，造成細(xì)胞病變效應(yīng)（Cytopathogenic effect，CPE）。病變細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)顆粒，H＆E染色可見胞質(zhì)萎縮空泡化，核膜增厚，顯微鏡下可見脫落的細(xì)胞變亮[20]。FHM和EPC細(xì)胞最敏感，為OIE推薦的分離病毒的細(xì)胞。EPC和FHM的最適溫度為20～25℃和20～22℃，產(chǎn)生的最大感染性為109TCID50/mL。該病毒除了在魚類細(xì)胞中增殖，還能在禽類、哺乳類和兩棲類動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)增殖。

6.1 傳統(tǒng)的檢測方法及免疫學(xué)方法

目前，國內(nèi)外常采用細(xì)胞培養(yǎng)法分離、檢測CSVV病毒，再通過中和試驗(yàn)確定。該方法雖然準(zhǔn)確率高，但檢測大約需要2周左右，耗時(shí)費(fèi)力。

在細(xì)胞培養(yǎng)分離病毒的基礎(chǔ)上，可采用免疫學(xué)的方法，如酶聯(lián)免疫吸附檢驗(yàn)（Enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）進(jìn)行鑒定、間接熒光抗體試 驗(yàn) （Indirect fluorescent antibody test，IFAT），但CSVV的囊膜來自宿主的細(xì)胞膜，易產(chǎn)生非特異性的抗體，因而病毒的抗血清效價(jià)不高，影響檢測結(jié)果[25]。CSVV在血清學(xué)上區(qū)別于其他彈狀病毒，采用ELISA可能會(huì)與其他魚類彈狀病毒如VHSV、IHNV等發(fā)生交叉反應(yīng)，還與PFRV有共同的抗原決定簇，在ELISA和間接熒光（IF）中有明顯的交叉反應(yīng)[26,27]。高隆英等[26]根據(jù)CSVV糖蛋白基因序列設(shè)計(jì)逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（RT-PCR）和半嵌套PCR（semi-nested-PCR）的引物 F1、R2、R4，其中 F1和R2可擴(kuò)增出CSVV核酸中的714bp片段，F(xiàn)1和R4可擴(kuò)增出606bp片段。特異性檢測結(jié)果表明，與VHSV、IHNV和PFRV無交叉反應(yīng)，具有良好的特異性，可在42h內(nèi)得到結(jié)果。

6.2 OIE檢測標(biāo)準(zhǔn)

根據(jù)OIE公布的《水產(chǎn)動(dòng)物檢測手冊》，目前我國出入境檢驗(yàn)檢疫行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)SN/T1152-2002以及我國規(guī)定的GB/T 15805.5-2008魚類檢疫方法，常規(guī)檢測CSVV方法是通過細(xì)胞培養(yǎng)分離病毒后，采用RT-PCR方法進(jìn)行診斷。該過程需經(jīng)過兩代的細(xì)胞培養(yǎng)，時(shí)間長，檢測效率低。王姝等[28]在國家行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)的基礎(chǔ)上，有機(jī)結(jié)合細(xì)胞培養(yǎng)法，利用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)ELISA進(jìn)行初步的篩選，再用RT-PCR復(fù)查，即實(shí)現(xiàn)高通量檢測，整個(gè)用時(shí)又比國家標(biāo)準(zhǔn)用時(shí)縮短了一半。

6.3 核酸探針檢測方法

Svetlana F等[29]根據(jù)CSVV-S30株的M和G基因的核酸序列設(shè)計(jì)引物，構(gòu)建生物素標(biāo)記的核酸探針，應(yīng)用RT-PCR和斑點(diǎn)雜交技術(shù)成功在感染CSVV的細(xì)胞培養(yǎng)液和魚組織中檢測出病原體，其中在腦組織中最易檢測出該病毒。利用生物素標(biāo)記的核酸探針方法，既實(shí)現(xiàn)了快速檢測，又提高了其靈敏度。

6.4 熒光RT-PCR檢測方法

張利峰等[30]根據(jù)鯉春病毒血癥病毒的核酸保守區(qū)序列，建立了快速檢測CSVV的熒光RT-PCR檢測技術(shù)，僅需4h就可以檢測出10-6病毒稀釋液，不僅試驗(yàn)周期短、靈敏，還實(shí)現(xiàn)了對病毒模版RNA的定量。安偉等[31]根據(jù)CSVV的核蛋白的保守序列，成功建立了SYBR Green I熒光定量RT-PCR檢測技術(shù)，病毒檢測下限100.76TCID50/mL，靈敏度高于常規(guī)PCR 100倍。

6.5 數(shù)字RT-PCR檢測方法

吳斌等[32]利用“油包水”的形式，對RT-PCR的擴(kuò)增反應(yīng)進(jìn)行計(jì)數(shù)，建立了數(shù)字RT-PCR的技術(shù)。與實(shí)時(shí)定量RT-PCR相比，在兩者均能檢測病毒的104稀釋倍數(shù)基礎(chǔ)上，擁有更高的靈敏度。

6.6 間接ELISA檢測方法

郭闖等[33]以超速離心法純化CSVV，免疫大白兔，制備了兔抗CSVV免疫血清，同時(shí)利用間接ELISA方法快速檢測CSVV，以兔抗SVCV血清1∶300稀釋后包被96孔酶標(biāo)板，滴度篩查CSVV陽性毒株，結(jié)果與RT-PCR鑒定結(jié)果相同。整個(gè)過程需要1 d，具有周期短、準(zhǔn)確的優(yōu)點(diǎn)。

6.7 新型液相芯片檢測技術(shù)

尹偉力等[34]根據(jù)GenBank中CSVV的G基因序列，找出25對保守堿基作為檢測探針，設(shè)計(jì)引物并進(jìn)行生物素標(biāo)記，通過液相芯片儀器檢測偶聯(lián)熒光編碼微球與CSVV的RT-PCR產(chǎn)物雜交反應(yīng)產(chǎn)生的熒光信號，發(fā)現(xiàn)液相芯片檢測體系在鑒別CSVV上具有高特異性和靈敏度，最低檢出量為10 pg。

6.8 環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)（Loop-mediated isothermalamplification，LAMP）

Shivappa等[35]對美國卡羅萊納州分離的CSVV菌株的G蛋白基因序列，設(shè)計(jì)出4套引物，分別進(jìn)行LAMP和RT-LAMP擴(kuò)增，證實(shí)建立的RT-LAMP對CSVV的檢測具有特異性，與RT-PCR的靈敏度相似，最低檢測量達(dá)101TCID50/mL。

陳進(jìn)會(huì)等[36]依照G基因保守序列，設(shè)計(jì)3套LAMP引物，通過恒溫實(shí)時(shí)熒光檢測系統(tǒng)ESE-Quant tube scanner，第1套和第3套有峰值，進(jìn)而引入環(huán)引物。結(jié)果顯示，第1套LAMP引物的檢測穩(wěn)定性、靈敏度和特異性效果最佳，能夠?qū)崿F(xiàn)高效檢測CSVV。因此，實(shí)時(shí)熒光LAMP法具有極佳的靈敏度和快速檢驗(yàn)的優(yōu)勢，適用于基層檢驗(yàn)，檢測限度可達(dá)到每反應(yīng)2.4 pg。

7 防治方法

目前對于該病沒有特效藥和有效的控制方法，只能通過化學(xué)、物理消毒的方式預(yù)防該病。一旦發(fā)現(xiàn)該病，應(yīng)及時(shí)中斷傳染源，隔離或撲殺病魚和帶毒魚，防止大規(guī)模疫病的爆發(fā)[31]。在20世紀(jì)80年代，歐洲出現(xiàn)了含CSVV和PFRV的二階滅活疫苗，能夠誘導(dǎo)鯉科魚類產(chǎn)生高效的中和抗體。隨后，成功開發(fā)了CSVV弱毒疫苗，在養(yǎng)殖漁業(yè)中有良好的應(yīng)用前景。給體質(zhì)量40～100g的鯉腹腔注射6.3×104TCID50后，免疫保護(hù)率在90%以上[37]。我國的CSVV疫苗研制還處于探索階段，主要的研究領(lǐng)域集中在減毒疫苗、亞單位疫苗及核酸疫苗等。

傳統(tǒng)滅活疫苗、減毒疫苗具有毒力返強(qiáng)的缺點(diǎn)[25]，需要添加佐劑，存在一定的安全隱患，應(yīng)用效果不穩(wěn)定。

DNA疫苗是90年代的最新一代疫苗，無需像傳統(tǒng)的滅活疫苗添加佐劑，卻仍具備傳統(tǒng)疫苗的優(yōu)點(diǎn)。DNA疫苗構(gòu)型更接近天然構(gòu)象，潛在致病性低，適于工廠化集中生產(chǎn)，相對安全，具有一定的應(yīng)用價(jià)值[38]。CSVV疫苗的研發(fā)有一定的進(jìn)展，Kanellos等[39]以CSVV G蛋白基因，設(shè)計(jì)了構(gòu)建穩(wěn)定性較好的DNA疫苗。為評估已構(gòu)建的4組CSVV糖蛋白DNA疫苗的免疫效果，歐陽征亮等[40]通過肌肉注射的免疫途徑誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生免疫。結(jié)果顯示：第一組重組質(zhì)粒DNA編碼全長的G蛋白疫苗保護(hù)率為14.47%；第二組重組質(zhì)粒DNA編碼去C端信號肽的G蛋白疫苗保護(hù)率為22.22%；第三組重組質(zhì)粒DNA編碼去N端跨膜區(qū)的G蛋白疫苗保護(hù)率為17.32%；重組質(zhì)粒DNA編碼同時(shí)去C端信號肽和N端跨膜區(qū)的G蛋白疫苗保護(hù)率為17.32%。Emmenegger等[41]的鯉攻毒試驗(yàn)驗(yàn)證，已構(gòu)建的CSVV的G蛋白DNA疫苗的保護(hù)效率為50%～88%，能夠有效降低感染鯉的死亡率。

8 展望

鯉春病毒血癥是一種高致病性、高死亡率的鯉科魚類傳染性疾病。目前，對該病毒的疫苗研制尚處于探索階段。盡管SVC的DNA疫苗已取得一定的進(jìn)步，但是在DNA疫苗的效率優(yōu)化、安全性以及疫苗的免疫途徑上仍然存在一些問題。同時(shí)，DNA疫苗的作用及代謝機(jī)制還有待進(jìn)一步探索[37]。