論文：一起石斑魚苗病毒性神經(jīng)壞死病的診斷

一起石斑魚苗病毒性神經(jīng)壞死病的診斷

陳 暉，肖 穎，方成俊，張東斌，余曉薇

（東山出入境檢驗(yàn)檢疫局，福建東山 363401）

2017年6—7月，福建省東山縣某石斑魚養(yǎng)殖場多批20～60日齡雜交石斑魚苗發(fā)病，臨床表現(xiàn)為游泳行為改變，致盲、打轉(zhuǎn)，魚體發(fā)黑，不食，繼而死亡，死亡率高達(dá)90%以上。多次應(yīng)用抗生素治療無效，寄生蟲、細(xì)菌學(xué)檢查為陰性。應(yīng)用世界動(dòng)物衛(wèi)生組織（OIE）推薦的檢測引物，采用RT-PCR檢測方法擴(kuò)增出神經(jīng)壞死病毒（NNV）特異性的421 bp基因片段，以此診斷為病毒性神經(jīng)壞死?。╒NN）。

雜交石斑魚苗；病毒性神經(jīng)壞死??；寄生蟲學(xué)檢查；細(xì)菌學(xué)檢查；RT-PCR

病毒性神經(jīng)壞死?。╒NN）又稱為病毒性腦病和視網(wǎng)膜?。╒ER），是一種流行于多種海水魚類的傳染病。該病病原為神經(jīng)壞死病毒（NNV），可導(dǎo)致病魚中樞神經(jīng)系統(tǒng)和視網(wǎng)膜引發(fā)空泡化病灶，從而引起魚類大量死亡。該病的死亡率取決于魚齡大小。一般20～60日齡魚苗感染后死亡率最高，可達(dá)90%以上，60日齡以上較大魚的感染率和致死率較低[1]。NNV歸屬于野田村病毒科乙型野田村病毒屬，病毒基因組由2個(gè)分子的單股正鏈RNA1和RNA2組成，分別編碼復(fù)制酶和衣殼蛋白[2-4]。在對(duì)RNA1的T4可變區(qū)域進(jìn)行分子進(jìn)化研究的基礎(chǔ)上，可將乙型野田村病毒分為4個(gè)主要基因型：SJNNV型、TPNNV型（鲀神經(jīng)壞死病毒型）、BFNNV型（鰈神經(jīng)壞死病毒型）和RGNNV型（石斑魚神經(jīng)壞死病毒型）[5]。迄今為止，已知可感染該病的魚種類達(dá)50余種，主要為海水魚類，其中受影響最大的是石斑魚、黃帶擬鲹和鰈魚等[6]。近幾年，我國南部省份養(yǎng)殖的各種石斑魚常常暴發(fā)流行VNN。其致死率非常高，給石斑魚養(yǎng)殖業(yè)造成很大的經(jīng)濟(jì)損失[7]。

逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）是世界動(dòng)物衛(wèi)生組織（OIE）推薦的檢測方法。采用RT-PCR檢測方法擴(kuò)增出NNV特異性的421 bp基因片段，是當(dāng)前檢測本病的最好檢測方法。該法對(duì)樣品處理的時(shí)間短，操作步驟清楚明了，特異性強(qiáng)、準(zhǔn)確度高，是快速檢測NNV的首選方法。

1 發(fā)病情況

福建省東山縣某石斑魚養(yǎng)殖場是一個(gè)新建的，環(huán)境良好、施設(shè)完備的石斑魚親魚、苗種繁殖和成魚養(yǎng)殖的較大型養(yǎng)殖場，養(yǎng)殖有紅斑魚、龍膽石斑魚、油斑魚、青斑魚親魚4種魚類。每年4—10月為繁殖期，5—7月為盛產(chǎn)期。本次發(fā)病魚苗是紅斑魚分別與龍膽石斑魚、油斑魚雜交的魚苗，發(fā)病日齡大多在20～60日齡，發(fā)病率和致死率都在90%以上。而單純青斑魚苗的發(fā)病日齡較遲，發(fā)病率和死亡率較低。

東山縣每年6—7月份的水溫一般保持在24～30 ℃。石斑魚親魚一般在受精卵孵化后約20 d，魚體長1.5～2 cm，翅未收縮完全時(shí)，開始發(fā)病，表現(xiàn)為魚體游泳行為改變，開始打轉(zhuǎn)，魚體背部開始發(fā)黑，但不影響進(jìn)食；繼續(xù)喂養(yǎng)蟯蟲類生物餌料3～5 d后，部分魚苗開始死亡，死亡率為50%左右。當(dāng)時(shí)場里采取了緊急應(yīng)對(duì)措施，如將發(fā)病魚苗與健康魚苗隔離，降低魚苗養(yǎng)殖密度，對(duì)發(fā)病魚池多次使用抗生素（氟苯尼考）藥浴，但無明顯治療效果。持續(xù)喂養(yǎng)至30～50 d，魚苗翅收縮完成后，部分健康魚苗也開始發(fā)病，表現(xiàn)為持續(xù)打轉(zhuǎn)，飄浮水面或沉于池底，肚子漲氣，鰓部出血，鰓絲膨脹，不進(jìn)食，處于半昏迷狀態(tài)，甚至出現(xiàn)爛肚、爛鰓并發(fā)癥，最終累記死亡率高達(dá)90%。一般孵化后20～60 d為魚發(fā)病的危險(xiǎn)期，60 d后魚體大于10 cm左右時(shí)，魚進(jìn)入安全期，一般不再發(fā)病。發(fā)病較嚴(yán)重的是紅斑魚分別與龍膽石斑魚、油斑魚雜交的魚苗。青斑魚一般發(fā)病1周后即可渡過危險(xiǎn)期。

2 實(shí)驗(yàn)室檢查

2.1 寄生蟲學(xué)檢查

采集多條瀕死病魚剖檢，取鰓片、眼、腸進(jìn)行壓片，解剖鏡下檢查，未見蟲體和蟲卵。

2.2 細(xì)菌學(xué)檢查

將孵化后20 d即開始發(fā)病的，且未進(jìn)行抗生素治療的瀕死病魚，取病變明顯的頭、眼等組織進(jìn)行研磨，接種含1%氯化鈉的肉湯培養(yǎng)液，30 ℃培養(yǎng)1 d；待肉湯混濁后，劃線接種TCBS平板，同樣30 ℃培養(yǎng)1 d。TCBS平板上可見少許黃色菌落，經(jīng)鑒定為溶藻弧菌。按常規(guī)辦法，再取上述菌落接種于1%氯化鈉的肉湯培養(yǎng)液，30 ℃培養(yǎng)1 d，再對(duì)健康石斑魚苗進(jìn)行毒力回歸試驗(yàn)，未出現(xiàn)上述病癥，說明溶藻弧菌不是引起上述病癥的病原。

2.3 RT-PCR方法檢測

2.3.1材料 活體采集發(fā)病后3個(gè)不同時(shí)期（20、35、50 d）游動(dòng)異常、食欲減低、體表色素漸變的瀕死石斑魚苗，凍存于?80 ℃冰箱備用。試驗(yàn)所用的磁珠法通用型RNA提取試劑盒，為賽默飛世爾科技中國有限公司產(chǎn)品；一步法RT-PCR試劑盒，購自寶生物工程（大連）有限公司；所用序列采用OIE 《水生動(dòng)物疾病診斷手冊(cè)》（第3版）推薦的引物。反向引物：5′-CGA GTC AAC ACG GGT GAA GA-3′；正向引物：5′-CGT GTC AGT CAT GTG TCG CT-3′。GeneGreen核酸染料，購自天根生化科技（北京）有限公司。

2.3.2方法

2.3.2.1組織樣品處理 取病魚腦、眼約50 mg，放在1.5 mL滅菌離心管中，用滅菌碾磨棒充分研磨搗爛，加1 mL裂解液。室溫孵育3 min，加200 μL氯仿，即三氯甲烷（Chloroform），小心蓋上蓋子，劇烈震蕩15 s，室溫孵育3 min，4 ℃ 12 000 r/min，離心15 min。取上清400 μL至5連管的第1孔內(nèi)。

2.3.2.2RNA提取 采用磁珠法提取RNA。在5連管內(nèi)分別加入試劑（表1）。提取全過程在磁珠提取純化系統(tǒng)中自動(dòng)進(jìn)行。

表1 5連管內(nèi)加入的試劑及劑量

2.3.2.3一步RT-PCR法 根據(jù)NNV擴(kuò)增片段大小，設(shè)置RT-PCR反應(yīng)體系：PCR模板5 μL，正、反向引物（40 μmo1）各2 μL，Taq酶（5mol/L）1 μL、10×Taq 酶緩沖液 7 μL、MgCI2（25 mmo1/L）6 μL、dNTP 2 μL、M-MuLV 逆轉(zhuǎn)錄酶（20 U/μL）1 μL、RNA 酶抑制劑（20 U/μL）0.5 μL，加滅菌雙蒸水至50 μL。程序設(shè)定為：首先42 ℃ 30 min、95 ℃5 min，然后 95 ℃ 40 s、55 ℃ 40 s、72 ℃ 40 s循環(huán)30次，最后72 ℃延伸5 min，4 ℃保存。

2.3.2.4PCR擴(kuò)增結(jié)果判定 用TBE電泳緩沖液配制2%的瓊脂糖（加入濃縮的10000×GeneGreen Nucleic Acid Dye，使其在凝膠中的終濃度為1×）進(jìn)行電泳，樣品孔中加入6 μL樣品和2 μL樣品緩沖液（含0.25%溴酚藍(lán)）的混合液，并設(shè)立DNA標(biāo)準(zhǔn)Marker作對(duì)照。電泳后在紫外檢測儀上觀察發(fā)現(xiàn)，在瓊脂糖電泳的421 bp位置均出現(xiàn)明顯的亮帶（圖1）。發(fā)病后3個(gè)不同時(shí)期的雜交石斑魚苗中均檢出NNV。

圖1 瓊脂糖凝膠電腦圖譜

3 結(jié)論

應(yīng)用 OIE推薦的檢測引物，采用RT-PCR檢測方法，最終證實(shí)該魚場石斑魚苗流行的是VNN，又稱病毒性腦病和視網(wǎng)膜病。

VNN主要影響魚苗和幼魚，通常疫病癥狀出現(xiàn)得越早，死亡率越高，魚苗階段感染后死亡率經(jīng)常高達(dá)100%。反之，育苗期間，該病發(fā)生的越遲，發(fā)病率和致死率越低。而本次流行病學(xué)調(diào)查發(fā)現(xiàn)，發(fā)病較嚴(yán)重的是紅斑魚分別與龍膽石斑、油斑魚雜交的魚苗。而青斑魚苗對(duì)NNV有較強(qiáng)的抵抗力，一般發(fā)病1周后即可渡過危險(xiǎn)期，發(fā)病率和致死率較低。

對(duì)VNN，目前無特效治療藥物，只能從預(yù)防入手。一是引進(jìn)培育對(duì)NNV有較強(qiáng)抗性的魚種，如青斑魚作為親本魚種；二是魚卵育苗前，可用聚乙烯吡咯烷酮碘（PVP-1）浸?。蝗窃陴B(yǎng)殖中，一旦發(fā)現(xiàn)病魚要及時(shí)撈出并進(jìn)行隔離養(yǎng)殖；四是夏季高溫期，要降低養(yǎng)殖密度，保持水流暢通，投放新鮮餌料。

致謝：

本次實(shí)驗(yàn)室檢測得到廈門出入境檢驗(yàn)檢疫局技術(shù)中心徐淑菲老師的指導(dǎo)，特此致謝！

[1] 世界動(dòng)物衛(wèi)生組織（OIE）. 水生動(dòng)物診斷試驗(yàn)手冊(cè)[M]. 6版. 北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，2016：465-470.

[2] SCHNEEMANN A，BALL L A，DELSERT C，et al. Eighth report of the international committee on Taxonomy of viruses[M]//FAUQUET C M，MAYO M A，MANILOFF J，et al. Family nodaviridae.in：virus taxonomy. London：Elsevier Academic Press，2005：865-872.

[3] BALL L A. Requirements for the self-directed replication of flock house virus RNA1[J]. Journal of virology，1995，69（2）：720-727.

[4] NAKAI T，NISHIZAWA T. Sequence of the nonstructural protein gene encoded by RNA1 of striped jack nervous necrosis virus [J]. Journal of general virology，1999（80）：3019-3022.

[5] NISHIZAWA T，F(xiàn)URUHASHI M，NAGAI T，et al.Genomic classification of fish nodaviruses by molecular phylogenetic analysis of the coat protein gene[J]. Applied and environmental microbiology，1997（63）：1633-1636.

[6] MUNDAY B L，KWANG J，MOO DY N. Betanodavirus infections of teleost fish：a review[J]. Journal of fish Disease，2002（25）：127-142.

[7] 陳信忠，蘇亞玲，龔艷清，等. 逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（RT-PCR）檢測5種養(yǎng)殖石斑魚的神經(jīng)壞死病毒[J].中國水產(chǎn)科學(xué)，2004，11（3）：202-207.