錦鯉皰疹病毒研究進(jìn)展

錦鯉皰疹病毒研究進(jìn)展

李瀟軒，朱天，楊志強(qiáng)，尹陸樂(lè)，李志輝，陳建清，韓飛

（江蘇省淡水水產(chǎn)研究所，南京 210017）

錦鯉皰疹病毒?。↘oiHerpesvirusDiease，KHVD），為皰疹病原科，鯉皰疹病毒屬，是由錦鯉皰疹病毒（Koi 540Herpesvirus,KHV）所誘發(fā)的一種致死率高達(dá)80～100%的流行性疾病。主要感染鯉魚，如錦鯉以及其他變異鯉科魚類。首次發(fā)現(xiàn)于1998年，由德國(guó)和以色列學(xué)者從患病的鯉魚和錦鯉中分離，并被得到證實(shí)的一種病毒。國(guó)內(nèi)2001年于香港發(fā)生首例皰疹病毒爆發(fā)事件，隨后在東南亞許多國(guó)家的也先后發(fā)生過(guò)皰疹病毒感染的事例。世界動(dòng)物衛(wèi)生組織（OIE）在2006年將KHVD列為強(qiáng)制性疾病。該文綜述了國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)于皰疹病毒最新發(fā)現(xiàn)與研究，以期為后續(xù)錦鯉皰疹病毒的研究以及實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)提供理論依據(jù)。

1 流行病學(xué)特征和臨床表現(xiàn)

1.1 國(guó)內(nèi)外流行現(xiàn)狀

1998年首次于德國(guó)和以色列發(fā)現(xiàn)錦鯉皰疹病毒，該疾病引起了大面積的錦鯉和鯉魚死亡事件。我國(guó)境內(nèi)第一例帶狀皰疹病毒感染事件發(fā)生于2001年的香港。該病在中國(guó)廣東省于2002年首次被發(fā)現(xiàn)[4]。目前這種疾病已在30多個(gè)國(guó)家爆發(fā)，尤其是錦鯉養(yǎng)殖大國(guó)日本和對(duì)錦鯉愛(ài)好眾多的中國(guó)廣東境內(nèi)，KHV爆發(fā)事件每年都會(huì)出現(xiàn)，但分布零星，在國(guó)內(nèi)很少成片爆發(fā)，是一種全球性的高致死率的鯉魚傳染病。

1.2 流行病學(xué)特征

KHVD作為一種流行病癥，感染面十分狹窄，目前并未發(fā)現(xiàn)有除鯉魚、錦鯉和其他鯉魚變異種外有患染這種疾病的魚類。且在有報(bào)導(dǎo)的皰疹病毒暴發(fā)事件中發(fā)現(xiàn)，錦鯉池塘相比普通鯉魚池塘更易感染和爆發(fā)皰疹病毒。皰疹病毒潛伏期約為7～15 d，其發(fā)病特點(diǎn)是當(dāng)水溫由冬入春或由夏入秋，當(dāng)水溫上升/下降到15～25℃的范圍時(shí)，會(huì)突然爆發(fā)并迅速擴(kuò)散，KHVD發(fā)病的最佳溫度在18～25℃這個(gè)溫度區(qū)間，當(dāng)水溫達(dá)到30℃以上時(shí)發(fā)病幾率變小，KHV在魚體中處于一個(gè)潛伏的狀態(tài)。研究發(fā)現(xiàn)，KHV已經(jīng)具備能夠在平均溫度為3℃的冰下繁殖能力[7]。KHV傳染性極強(qiáng)，且傳染方式較多，且在水中就能夠傳播，通過(guò)魚體排泄出的尿液、糞便和體液均可迅速傳播，且感染率極高，潛伏期7～15 d，一旦發(fā)病，死亡率高達(dá)80%～100%，當(dāng)前從國(guó)外引進(jìn)錦鯉需通過(guò)質(zhì)檢中心檢疫病毒，一旦發(fā)現(xiàn)病例，采取聯(lián)合當(dāng)?shù)貪O政部門組織進(jìn)行該批次鯉魚、錦鯉的全塘滅殺的措施。

1.3 臨床表現(xiàn)

錦鯉皰疹病毒主要集中爆發(fā)于春季錦鯉產(chǎn)卵前，3—5月，鯉魚越冬后水溫急劇上升至15～25℃的這段時(shí)期。發(fā)病前期錦鯉攝食量正?；蛘哂兴黾樱l(fā)病期仍能攝食，在民間養(yǎng)殖戶稱“該吃的吃，該死的死”。錦鯉在感染KHV病毒后病發(fā)癥狀可分為三個(gè)時(shí)期，各個(gè)時(shí)期癥狀具有一定差異。病毒感染初期病魚浮于水面不動(dòng)或游動(dòng)緩慢，部分病魚體表發(fā)黑，鱗片脫落，皮下和肌肉出血，肛門略微紅腫；鰭條、尾鰭充血，生病的魚絲呈暗紅色，減去一個(gè)完整的痰液，血流量比正常魚慢，而且容易結(jié)痂；腸道紅色，硬而且相當(dāng)充盈，腎臟腫脹，膽汁顏色較深，顏色為紅色，脾臟有多個(gè)出血點(diǎn)。病毒感染中期魚體游動(dòng)緩慢，與進(jìn)入麻醉狀態(tài)的魚體表現(xiàn)相似，魚體體色暗淡，呈灰白色，中后期表現(xiàn)出花斑，特別是德國(guó)鯉之類的無(wú)鱗錦鯉在水中病癥尤為明顯，鱗片魚沒(méi)有顯示明顯，并且帽子和絲綢流血并產(chǎn)生大量粘液。病毒感染后期，打撈出水面后病魚魚體體色發(fā)黑，雙眼嚴(yán)重凹陷，腮部腫脹發(fā)紫紅色，極易出血。通?；加蠯HV病毒的病魚在1～2 d內(nèi)死亡，病毒感染率高，病死率高。且易發(fā)生在體態(tài)肥碩的錦鯉身上，對(duì)觀賞魚錦鯉行業(yè)具有嚴(yán)重的打擊性。

2 錦鯉皰疹病毒病原體

2.1 KHV的分類和命名

KHV為皰疹病毒科、鯉皰疹病毒屬、鯉皰疹病毒3型。經(jīng)過(guò)結(jié)合皰疹病毒發(fā)病癥狀，最終被命名為錦鯉皰疹病毒（KHV）。KHV形態(tài)結(jié)構(gòu)類似于兩種不同魚類的皰疹病毒，但它在臨床表現(xiàn)，生長(zhǎng)特征，細(xì)胞變異類型，感染范圍和抗原性方面不同[8]。

2.2 KHV分子生物學(xué)特性

KHV為直徑100～110 nm的二十面體，是一種較大的線性、雙鏈DNA病毒。屬皰疹病毒目（Herpesvirales）、魚類皰疹病毒科（Alloherpesviri－dae）[4]，病毒表面具有螺旋結(jié)構(gòu)，在細(xì)胞核中具有不對(duì)稱的電子致密區(qū)域?；蚪M大小為295 kb，內(nèi)含156個(gè)開(kāi)放閱讀框（ORF）、末端8個(gè)重復(fù)序列。末端含22個(gè)正向重復(fù)序列，GC含量占總核苷酸的59.2%。病毒粒子成熟后呈球形，直徑在170～230 nm之間。核衣殼呈二十面體的球狀，直徑約110 nm。結(jié)構(gòu)對(duì)稱，并且被囊狀結(jié)構(gòu)包圍。水溫達(dá)到15～25℃時(shí)，KHV可以存活將近4 h，并且在魚體的分泌物和塘底淤泥中能夠存活更多的時(shí)間。水溫和鹽堿度是影響病毒的重要因素之一，在60℃的溫度條件下持續(xù)30 min或pH小于3或高于11的條件下，病毒將會(huì)失去感染能力。使用氯仿、250 mg/L的乙醚或1 mg/L TritonX-100可完成對(duì)細(xì)菌的滅活。

2.3 關(guān)于KHV基因組結(jié)構(gòu)的研究

KHV的主要基因型已被鑒定出，但全基因組結(jié)構(gòu)尚未確定，且對(duì)于編碼蛋白的功能尚未有明確的研究成果。已經(jīng)成功克隆出個(gè)別較保守且確定功能的ORF。

2.3.1 結(jié)構(gòu)蛋白 2010年，MichelB等人構(gòu)建出了KHV的蛋白結(jié)構(gòu)。KHV的蛋白結(jié)構(gòu)由：核衣殼蛋白（ORF72、ORF78、ORF92）、囊膜蛋白（ORF25、ORF32、ORF59、ORF65、ORF81、ORF99、ORF108、ORF115、ORF131、ORF132、ORF136、ORF148、ORF149）、間質(zhì)蛋白（ORF62、ORF132）和22個(gè)未分類蛋白[5]組成。但其功能還未能夠被全部驗(yàn)證。構(gòu)建KHV的主要結(jié)構(gòu)蛋白[7]是細(xì)胞質(zhì)中存在ORF25的表達(dá)蛋白。

2.3.2 非結(jié)構(gòu)蛋白 非結(jié)構(gòu)蛋白是由病毒基因組編碼，參與病毒的復(fù)制和基因表達(dá)調(diào)控，但與病毒顆?；ゲ幌嗳莸牡鞍踪|(zhì)。根據(jù)蛋白質(zhì)功能的不同，將KHV的非蛋白結(jié)構(gòu)分類為：ORF2家族、TNFR家族（腫瘤壞死因子受體）、ORF22家族、ORF25家族和Ring家族。ORF2 家族包含：ORF2、ORF9[9]。TNFR 家族包含：ORF4、ORF12。TNFR家族包含兩個(gè)基因（ORF4/12）編碼具有TNFR基序的蛋白質(zhì)。6個(gè)膜蛋白：ORF25、ORF26、ORF27、ORF65[7]，ORF148 和 ORF149；RING家族共具有四個(gè)蛋白（ORF41、ORF128、ORF144、ORF150）的編碼，均含有鋅指結(jié)構(gòu)（RING Finger）特征基序。dTTP是組成DNA分子的基本成分，TK基因的功能是將脫氧胸苷核苷酸催化成dTMP，然后將其磷酸化成dTTP，間接參與合成dCTP、dGTP和dATP等物質(zhì)的過(guò)程。該基因決定了KHV的潛伏狀態(tài)，以及在一定條件誘導(dǎo)下的爆發(fā)，所以學(xué)者們普遍認(rèn)同的觀點(diǎn)是KHV毒力來(lái)源于TK基因，對(duì)應(yīng)胸苷激酶ORF55。ORF150為RING家族脂蛋白，ORF56為糖蛋白，膜蛋白ORF22，主要衣殼蛋白ORF92，ORF23 編碼白介素-10。

2.4 傳播途徑

目前在感染KHV的病魚排泄物和體液中均檢測(cè)到了KHV的病毒DNA，所以大多數(shù)學(xué)者認(rèn)為KHV在水中傳播，且冬日水溫降低之后病毒潛伏在糞便之中，春季水溫升高時(shí)開(kāi)始集中爆發(fā)并傳染，這也是春季皰疹病盛行的因素之一。但在錦鯉皰疹病毒爆發(fā)規(guī)模較大的日本，學(xué)者們認(rèn)為皰疹病毒的傳播途徑主要是通過(guò)魚類的尿液，尿液攜帶病毒進(jìn)入共同水域從而感染其他魚體。

3 皰疹病毒的檢測(cè)方法

由于KHV具有潛伏期長(zhǎng)、傳染率高和易感染等特點(diǎn)，且由于缺乏對(duì)皰疹病毒有效的治療方案以及傳染的預(yù)防措施，所以在國(guó)內(nèi)養(yǎng)殖場(chǎng)或從國(guó)外進(jìn)口錦鯉的檢疫隔離期間，一旦發(fā)現(xiàn)KHV的存在立即執(zhí)行全塘/池滅殺。隨著日本福岡縣與江蘇省建交25周年，日方贈(zèng)予江蘇省220條日本錦鯉，全國(guó)規(guī)模最大設(shè)施最豪華的檢驗(yàn)檢疫隔離場(chǎng)坐落南京，打開(kāi)了一扇新的錦鯉進(jìn)出口窗口，再加上近年“錦鯉”一詞在網(wǎng)絡(luò)上的爆紅，進(jìn)口錦鯉與養(yǎng)殖錦鯉的玩家越來(lái)越多，所以為了降低錦鯉養(yǎng)殖的風(fēng)險(xiǎn)以及愛(ài)好者的損失，該行業(yè)迫切的需要一種能夠及時(shí)發(fā)現(xiàn)病毒，并且耗費(fèi)成本較低的檢測(cè)方法，以降低KHV帶來(lái)的經(jīng)濟(jì)損失。到目前為止，通過(guò)不斷的研究和實(shí)驗(yàn)，研究出了許多錦鯉皰疹病毒的檢測(cè)方法：細(xì)胞分離培養(yǎng)試驗(yàn)，血清中和試驗(yàn)和分子生物學(xué)試驗(yàn)[22]。

3.1 細(xì)胞分離培養(yǎng)技術(shù)

3.1.1 環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增（LAMP） 通過(guò)不斷研究和改進(jìn)，使用環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增（LAMP）法測(cè)定錦鯉皰疹病毒的特異性和敏感度越來(lái)越高。Wen-HSin等建立了一個(gè)在集成微流體系，運(yùn)用LAMP方法分離病原[27]，僅使用90 min，便可完成對(duì)4種病原的檢測(cè)，而PCR技術(shù)需要較長(zhǎng)的檢測(cè)時(shí)間才能得出準(zhǔn)確結(jié)果，LAMP也能得出相對(duì)準(zhǔn)確的結(jié)果。因此,隨著科學(xué)研究的發(fā)展，LAMP極有可能成為快速檢測(cè)KHV的主流方法。

3.1.2 分子生物學(xué)診斷方法（PCR） PCR技術(shù)是當(dāng)前被廣泛用于檢測(cè)KHV的方法，檢測(cè)方法相對(duì)具體和敏感，可以取魚體鰓部樣本進(jìn)行初級(jí)檢測(cè)，但是要進(jìn)行完整檢測(cè)需取6處不同的樣本，但此方法涉及魚體的腎、臟，所以僅適用于死魚檢測(cè)。在國(guó)外私營(yíng)性質(zhì)的工作室會(huì)采用PCR技術(shù)進(jìn)行取腮樣本的初步試驗(yàn)，來(lái)降低出口錦鯉攜帶KHV的可能性，但不進(jìn)行完整檢測(cè)仍然無(wú)法規(guī)避這一風(fēng)險(xiǎn)。

3.1.3 其他檢測(cè)方法 除了上述兩種常見(jiàn)的檢測(cè)KHV的方法外，國(guó)內(nèi)還有ELISA、電子顯微鏡技術(shù)和原位雜交技術(shù)等檢測(cè)方法。但是ELISA法花費(fèi)較大，而且與CCV和CHV會(huì)發(fā)生交叉免疫反應(yīng)，因此有學(xué)者認(rèn)為它不適合日常檢測(cè)和推廣。電子顯微技術(shù)和原位雜交技術(shù)所需要的設(shè)備費(fèi)用十分昂貴，更不利于日常檢測(cè)和推廣。

4 錦鯉皰疹病毒防控措施

KHVD具有高傳染性和高感染性的特征，一旦爆發(fā)將帶給鯉魚、錦鯉養(yǎng)殖戶及錦鯉愛(ài)好者巨大的經(jīng)濟(jì)損失，及時(shí)檢測(cè)和進(jìn)行防控有助于降低這一損失。

4.1 免疫預(yù)防

目前防制KHV的最有效方法是使用疫苗免疫，減毒疫苗已經(jīng)由開(kāi)發(fā)商投入并在一些規(guī)模較大的漁場(chǎng)投入使用。減毒疫苗對(duì)魚的免疫保護(hù)的效應(yīng)期可達(dá)8個(gè)月以上，但目前在對(duì)行業(yè)中已經(jīng)開(kāi)始投入使用的研究中發(fā)現(xiàn)，并不能夠?qū)υ摬∏榈目刂坪筒《久庖弋a(chǎn)生理想的效果。目前，該疫苗證明對(duì)皰疹病毒的的有效處理方式是配合疫苗通過(guò)變溫或在細(xì)胞上連續(xù)傳代獲得突變株，效應(yīng)期間，通過(guò)試驗(yàn)減毒疫苗免疫的錦鯉和鯉魚免疫保護(hù)率在理論上可達(dá)到80%以上。減毒疫苗可以有效地刺激魚的細(xì)胞免疫功能，并且延長(zhǎng)細(xì)胞的免疫時(shí)間，具有廣泛的特異性，但是減毒疫苗可能會(huì)發(fā)生病毒變異和毒散，造成一定的負(fù)面影響。

4.2 其他防治措施

部分研究[27]相信，KHVD的流行性根本原因在于水溫的季節(jié)性變化，并認(rèn)為控制水溫即可控制病毒爆發(fā)。但是最新研究發(fā)現(xiàn)即便在冰下，KHV仍然能夠繁殖，所以控制溫度并不能在根本上解決病毒爆發(fā)的問(wèn)題。部分錦鯉研究者想通過(guò)篩選具有抗病性的錦鯉家系來(lái)減少錦鯉皰疹病毒帶來(lái)的危害，但是目前篩選效果不理想且并未出現(xiàn)對(duì)于錦鯉皰疹病毒產(chǎn)生抗體的錦鯉品系。

5 錦鯉皰疹病毒的發(fā)展前景

KHVD自發(fā)現(xiàn)以來(lái)對(duì)錦鯉行業(yè)產(chǎn)生了巨大的影響，國(guó)內(nèi)目前還沒(méi)研究出能夠防治KHVD的有效措施，且缺乏有效的防控手段，所以一旦檢測(cè)發(fā)現(xiàn)攜帶錦鯉皰疹病毒的病魚需立即執(zhí)行同一水域的全塘滅殺，這種直接的處理方式對(duì)錦鯉愛(ài)好者及鯉魚、錦鯉養(yǎng)殖戶會(huì)帶來(lái)十分慘重的損失。隨著觀賞魚行業(yè)的開(kāi)拓和錦鯉受眾者的增多，防治皰疹病毒研究的步伐也在不斷加快。KHV從出現(xiàn)到開(kāi)始在全球呈流行性爆發(fā)已經(jīng)持續(xù)了二十多年之久，但由于其宿主范圍十分狹窄且病毒結(jié)構(gòu)十分復(fù)雜，國(guó)內(nèi)對(duì)于皰疹病毒的研究仍舊比較稀缺。在錦鯉養(yǎng)殖規(guī)模最大的日本，許多學(xué)者認(rèn)為皰疹病毒的爆發(fā)并非是一種自發(fā)性的爆發(fā)，而是受水溫以及環(huán)境因素的誘導(dǎo)而形成爆發(fā)的一種病毒；而且在病毒出現(xiàn)長(zhǎng)達(dá)的20年間，并未有能夠產(chǎn)生抗體的錦鯉家系出現(xiàn)，所以通過(guò)篩選優(yōu)良家系來(lái)對(duì)抗KHV的顯得十分困難，且針對(duì)皰疹病毒的疫苗雖然能夠在理論上達(dá)到防治KHV的效果，但在實(shí)際使用中的效果并不理想。

近年錦鯉已經(jīng)重新獲得了進(jìn)出口的允許，為規(guī)避從外來(lái)的鯉科魚類、特別是錦鯉體內(nèi)攜帶皰疹病毒進(jìn)入內(nèi)地的可能性，中國(guó)海關(guān)要求進(jìn)口錦鯉需要在隔離場(chǎng)內(nèi)進(jìn)行為期一個(gè)月的隔離，并在當(dāng)?shù)刭|(zhì)檢中心對(duì)進(jìn)境錦鯉進(jìn)行兩次的抽樣調(diào)查檢測(cè)，保證對(duì)外來(lái)病毒的入侵的嚴(yán)格把控。但國(guó)內(nèi)還存在不少攜帶錦鯉皰疹病毒的病魚，如何有效地治療已經(jīng)感染的病魚及防止與其共用同一水體健康魚體感染皰疹病毒顯得尤為重要，研究開(kāi)發(fā)真正能夠用于生產(chǎn)上的基因疫苗，防止病毒擴(kuò)散，并控制KHV的全球性暴發(fā)，從而減少養(yǎng)殖戶和觀賞魚玩家的經(jīng)濟(jì)損失，確保錦鯉和鯉魚養(yǎng)殖業(yè)乃至休閑漁業(yè)的健康發(fā)展。