揭示水產養(yǎng)殖中水霉菌繁殖和侵染過程

水霉病又稱為膚霉病、白毛病，是淡水養(yǎng)殖動物常見致病菌。水霉（Saprolegnia）隸屬于茸鞭生物界（Stramenopila）、鞭毛菌亞門（Mastigomycotina）、卵菌綱（Oomycetes）、水霉目（Saprolegniales）、水霉科（Sprolegniaceae），主要包括水霉屬（Saprolegnia）、綿霉屬（Achlya）、絲囊菌屬（Aphanomyces）等。水霉病常年發(fā)生，尤其是在冬春兩季。水霉病的發(fā)生主要是水霉孢子大量繁殖、魚體表受傷或免疫力下降和溫度驟變等原因共同造成（Behrens等，1994；Khulbe等，1995）。

水霉繁殖包括有性繁殖和無性繁殖，其中無性繁殖最為常見。水霉的無性繁殖是指在適當環(huán)境條件下，水霉菌絲發(fā)育為游動孢子囊，游動孢子囊內形成游動孢子，游動孢子囊頂端形成小孔，具有兩根頂生鞭毛的梨形孢子（第一型游動孢子）逸出，經過短期游動后，進入靜止期，后在靜體上形成一個具有兩根側生鞭毛的腎形孢子（第二型游動孢子），再經過短時間游動后就休止，休止孢子萌發(fā)成芽管，芽管發(fā)育成新的菌絲。

圖1 水霉無性繁殖（引自Hughes，1994；）

A：菌絲；B：孢子囊；C：游動孢子釋放；D初生游動孢子（第一型游動孢子）；E-F：初生孢孢子（靜止）；G：釋放次生游動孢子；H：次生游動孢子（第二型游動孢子）；I：次生孢孢子；J：孢子萌發(fā)。

水霉的有性繁殖是在條件有利有性生殖時，營養(yǎng)菌絲上形成較大的球狀藏卵器和較小的菌絲狀雄器。藏卵器球形或梨形，多數(shù)頂生，少數(shù)側生。藏卵器具有雄性器官，雄器短而粗與藏卵器同枝，少數(shù)異枝。減數(shù)分裂則在配子囊內發(fā)生，雄器通過受精管穿過藏卵器壁到達卵球，進行質配和核配。

受精后形成卵孢子，卵孢子分化呈中央型或亞中央型，每個藏卵器3～25個卵孢子不等，卵孢子由藏卵器壁的分解而釋出，經過3～4個月休眠后萌發(fā)產生具有短柄的游動孢子囊或菌絲，完成整個生活史。

圖2 水霉有性生殖（引自夏文偉，2011）

A：藏卵器與雄器異枝；B: 藏卵器與雄器同枝

本實驗以水霉菌標準菌株為研究對象，通過對水霉菌落形態(tài)和繁殖過程的顯微鏡觀察，從而了解水霉菌的生長形態(tài)，水霉菌的生長繁殖過程，水霉菌孢子釋放過程等，為鑒定和預防水霉病提供參考依據(jù)。

1 .材料和方法

1.1 實驗材料

供試菌株：致病性水霉菌保存于武漢華揚動物保健集團技術中心。實驗試劑：PDA（Potato Dextrose Agar）培養(yǎng)基（青島高科技工業(yè)園海博生物技術有限公司）。實驗儀器：恒溫培養(yǎng)箱，光學顯微鏡，電子天平，高壓蒸汽滅菌鍋等。

1.2 實驗方法

將保種的水霉菌涂布于PDA培養(yǎng)基，28℃恒溫培養(yǎng)。待長出單菌落后，將單菌落接種至50ml PDA液體培養(yǎng)基，28℃搖床培養(yǎng)4-5d，制備水霉菌液，制片并在顯微鏡下觀察。將300ul水霉菌液涂布PDA平板，28℃恒溫培養(yǎng)4-5d，持續(xù)觀察水霉菌落形態(tài)，待水霉菌絲長滿整個平板后，加入10ml無菌水并輕刮表面，使水霉孢子充分融入無菌水中。將混有水霉孢子無菌水至離心管中，3000rpm離心5min，除去菌絲等雜質。制備水霉孢子液制片并顯微觀察。

2 .實驗結果與分析

2.1 水霉菌落結果與分析

通過對水霉菌落持續(xù)觀察，結果顯示，水霉菌在PDA培養(yǎng)基培養(yǎng)24h時，同一平板不同單菌落生長快慢有差異。初始水霉菌落形態(tài)無規(guī)則，顏色較淺（圖3A）。培養(yǎng)48 h，水霉菌落呈放射狀生長，菌落為規(guī)則的圓形，邊緣整齊，菌絲深入到瓊脂內部，交織成網狀，生長在瓊脂外部為灰白色絮狀物（圖3B）。之后繼續(xù)培養(yǎng)，菌絲長滿整個培養(yǎng)基（圖3C）。實驗結果對水霉病防控具有一定指導意義，水霉病重在預防，一旦水霉病爆發(fā)，菌絲向內生長，會深入肌肉很難殺滅。提前預防，可以將水霉菌絲和水霉孢子殺滅在水體中，避免通過傷口感染魚體。

圖3 水霉菌落形態(tài)

A：24h水霉菌落形態(tài)；B：48h水霉菌落形態(tài)；C：72h水霉菌落形態(tài).該實驗觀察菌落形態(tài)與圖4相似（夏文偉，2011；粱永增2016）。

圖4 水霉菌落形態(tài)（引自夏文偉，2011；粱永增，2016）

2.2 水霉顯微鏡結果與分析

水霉孢子液和水霉菌液制片在顯微鏡下觀察結果如圖5，結果顯示，孢子多為游動，形狀為近似圓形。水霉孢子游動，也導致了水霉病傳染迅速。因此，水霉病一定要早發(fā)現(xiàn)早治療。待看到魚體表有白毛時，會釋放更多的水霉孢子到水體中，加重水霉的感染。

① A

② B

① C

② D

圖5水霉孢子

A：水霉孢子液孢子（40 x）；B: 水霉孢子液孢子（100x）；C：水霉菌液孢子（40 x）；B: 水霉菌液孢子（100 x）

該實驗觀察水霉孢子形態(tài)與圖6相似（劉榮軍，2014；韓靈莉；2017）。

圖6 水霉孢子（引自劉榮軍，2014；韓靈莉；2017）

水霉菌液顯微結果顯示，水霉菌絲為透明管狀結構，中間無橫隔，分支較少，細長。頂端為游動孢子囊，且多呈棒狀（圖7）。

圖7 水霉菌絲與孢子囊（40x）

該實驗觀察水霉菌絲與孢子囊形態(tài)與圖8相似（許佳露， 2012）。

圖8 水霉菌絲與孢子囊（引自許佳露，2012）

孢子囊中有游動孢子，游動孢子呈多排排列，發(fā)育成熟后從孢子囊頂端釋放出來，并迅速游離（圖9）。水霉病的防控需要注意，一旦看到長白毛的病魚，及時撈出，避免菌絲末端孢子囊釋放孢子到水體中感染更多的魚。

圖9水霉孢子囊釋放孢子（100x）

該實驗觀察水霉孢子囊釋放孢子過程與圖10相似（Ke等，2009；許佳露，2012；夏文偉，2011）。

圖10水霉孢子囊釋放孢子（引自Ke等，2009；許佳露，2012；夏文偉，2011）

圖11 新游動孢子囊以內層出方式產生（40x）

該實驗觀察水霉新游動孢子囊以內層出方式產生與圖12相似（許佳露，2012；Ke等，2009；張楠，2014）。

圖12 新游動孢子囊以內層出方式產生（引自許佳露，2012；Ke等，2009；張楠，2014）

3. 討論

本文揭示了水霉菌的繁殖過程是菌絲大量生長后，在菌絲的末端長出孢子囊，孢子囊一定程度后會從頂端釋放孢子，游動孢子在水體和魚體遇到合適機會會萌發(fā)生長，長出新的菌絲繼續(xù)繁殖。水霉病的發(fā)生過程可以是孢子侵染傷口或菌絲粘附傷口，導致水霉菌大量繁殖引起發(fā)病。水霉病的防控一定要注意的是，用能殺滅游動孢子的產品提前殺滅孢子，避免魚體表面的菌絲末端孢子囊釋放更多游動孢子。

水霉菌是水產動物重要致病菌，感染的水產動物體表覆蓋白色絮狀物菌絲，同時伴隨食欲不振，躁動不安和免疫下降。水霉孢子大量繁殖可引起水產動物水霉病爆發(fā)。本研究水霉菌落形態(tài)結果顯示，水霉在PDA培養(yǎng)基上形成的菌落呈放射狀，菌落為規(guī)則的圓形，邊緣整齊，菌絲深入到瓊脂內部，交織成網狀，生長在瓊脂外部份，為灰白色絮狀物；水霉顯微鏡觀察結果顯示，水霉菌絲為透明管狀結構，頂端為游動孢子囊，孢子囊中有游動孢子，發(fā)育成熟后從孢子囊頂端釋放出來，并迅速游離，孢子從孢子囊釋放后，孢子囊前端成為空囊，新游動孢子囊會以內層擴散方式重新形成。

水霉病的發(fā)生特點？水霉發(fā)生溫度范圍廣，水霉孢子在自然環(huán)境大量存在，對環(huán)境耐受性極強，對溫度適應范圍很廣；水霉發(fā)生主要受溫度影響，當水溫低于20℃時水霉病原菌適宜繁殖,其最適繁殖溫度為10-18℃，水霉菌在15℃左右時生長最活躍，水溫高于28℃才能抑制水霉孢子繁殖。因此，水霉病并不是只有冬季低溫期發(fā)生，水溫低于20℃都要預防該病的發(fā)生；水霉發(fā)生的后期，水霉菌菌絲著生在水體表傷口后，菌絲會深入肌肉，很難殺滅，因此水霉病主要靠預防。在水霉適宜繁殖的季節(jié)（水溫低于20℃）提前使用藥物將水霉孢子殺滅在水體中（如華揚君美凈）；水霉菌感染對象多，水霉病是由水霉菌引起的真菌性疾病，對水生動物種類沒有選擇性，凡受傷的機體和卵均可被感染致病。

如何有效防控水霉??？

（1）選擇有效防治水霉病的藥物很關鍵。防治水霉病的藥物有很多種，如何選擇有效藥物直接決定了防治效果。防治水霉病的藥物可以分為抑菌型的主要用于預防，如硫醚沙星等，主要是抑制水霉菌的生長，一旦觀察到白毛菌絲，如果不能殺菌是沒有治療效果的；有去除菌絲性和恢復傷口型的，如五倍子、水楊酸等，主要用于脫落菌絲和收斂傷口，不能殺滅水霉，也起不到治療效果；一種是治療型的，具有殺菌效果，可以殺滅水霉菌，具有真正的治療效果。華揚君美凈融合了五倍子提取物收斂傷口和抑殺水霉菌的雙重效果具有很好的防治水霉病效果。

（2）秋冬捕魚時，避免和減少魚體受傷。

（3）及時殺滅水體和魚體體表寄生蟲，減少寄生蟲造成傷口和病菌傳播。

（4）越冬前提前內服應激寧等中藥類產品，提升魚體體質，增氧機體免疫力。

（5）在水霉適宜繁殖季節(jié)（水溫10-18℃）提前使用可抑殺水霉孢子的產品，將水霉孢子抑殺在水體中。

4 參考文獻

[1] Behrens P W, Sicotte V J, Delent s J. Microalgae as asource of stable iso topically labeled compounds.Journal of Applied Phycology, 1994, 6 (2): 113- 121.

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