論文：虹鱒卵孵化中水霉病的防控

       虹鱒卵孵化中水霉病的防控

       張元

    （山西省水產(chǎn)育種養(yǎng)殖科學實驗中心，山西 太原 030002）

在水溫9～11℃下，研究不同濃度過氧化氫、甲醛、聚維酮碘和中草藥（五倍子、麻黃等）浸提液對虹鱒受精卵發(fā)眼率、孵化率和畸形率的影響。結(jié)果表明：聚維酮碘不適合用于虹鱒受精卵水霉病的防治，其他三種消毒劑的最佳藥浴濃度分別為過氧化氫1 000mg/L、甲醛1 500 mg/L、中草藥浸液50mL（僅限于本試驗配方），發(fā)眼率可分別提高到發(fā)眼率可分別提高到（96.54±1.16）%、（97.76±2.36）%、（94.26±3.58）%，孵化率可分別提高到（97.99±0.13）%、（98.24±1.09）%、（98.10±1.09）%。將這三種消素劑兩兩交替使用后，發(fā)現(xiàn)過氧化氫和中草藥的防治效果不低于甲醛，為今后研發(fā)防治水霉菌的無公害新型藥物提供基礎(chǔ)性數(shù)據(jù)。同時，建議在孵化中建立一套科學、嚴格、有效的防疫體系，既可大大減少消毒劑的使用量，又可真正達到安全、高效、價廉。

虹鱒受精卵；發(fā)眼率；孵化率；畸形率；防控水霉病

虹鱒Oncorhynchus mykiss原產(chǎn)于北美洲的太平洋沿岸，目前成為世界上養(yǎng)殖分布最廣的魚類之一[1]。虹鱒肉質(zhì)肥厚細嫩、味鮮美、無腥、營養(yǎng)價值高，在淡水和海水中均能養(yǎng)殖，適宜于高度集約化養(yǎng)殖。我國的虹鱒人工繁殖、養(yǎng)殖技術(shù)日趨成熟，現(xiàn)已在我國大部分地區(qū)進行養(yǎng)殖，尤以黃河流域及其以北地區(qū)最盛[2,3]。

然而，虹鱒受精卵孵化溫度較低、孵化時間較長，極易感染水霉Saprolegnia，嚴重影響成活率和養(yǎng)殖效益。水霉菌對寄主沒有嚴格的選擇性，可以感染草魚Grass carp、虹鱒、黑魚Ophicephalus argus等諸多水產(chǎn)養(yǎng)殖動物的各個生長階段，使卵、苗種或成體患染水霉?。ㄓ址Q膚霉病或白毛?。?，具有極大的危害性[4-6]?？兹甘G曾是預(yù)防、治療水霉病的有效藥物，但由于其“高毒性、高殘留、高致癌”，2002年被農(nóng)業(yè)部列入《食品動物禁用的獸藥及其它化合物清單》[7,8]。目前生產(chǎn)中常用的替代藥物，如氯化鈉、甲醛、過氧化氫、高錳酸鉀、二氧化氯、聚維酮碘、臭氧、中草藥等，低劑量使用時，往往難以徹底抑制水霉菌生長，而某些藥物高劑量使用又會造成畸形苗或潛在藥殘危害。本研究采用試驗生態(tài)學方法研究不同濃度過氧化氫、甲醛、聚維酮碘和中草藥浸提液對虹鱒受精卵發(fā)眼率、孵化率和畸形率的影響，旨在摸索一套高效、安全、價廉的虹鱒受精卵水霉病防治體系，以提高孵化效率。

1 材料與方法

1.1 材料

本試驗在山西省水產(chǎn)育種養(yǎng)殖科學實驗中心朔州虹鱒魚實驗場進行。通過人工催產(chǎn)、授精方式獲得虹鱒受精卵。平行組與各實驗組均取受精卵約1萬粒，平均卵徑為（5.22±0.64）mm，置于10L的桶式孵化器中孵化。試驗過程中，水體的溶解氧平均值為（6.89±0.43）mg/L（使用JENCO 9010M測定），pH為（7.82±0.01）（使用HANNAHI 8424測定）。

過氧化氫溶液（分析純30%，哈爾濱新春化工有限公司）、甲醛溶液（濃度37%，南京化學試劑股份有限公司）、聚維酮碘（山西益鑫泰生物科技有限公司）、中草藥（五倍子、麻黃、土槿皮、旱煙草桿、大蒜素等）。中草藥粉碎后取15g，于4℃下浸泡6h以上，用100mL蒸餾水煮沸后再文火煎煮40min，重復(fù)煮3次后合并煮液，加熱濃縮至150mL備用，使用時再用蒸餾水稀釋10倍即得到中草藥浸提液。

1.2 方法

首先篩選消毒劑種類和使用劑量。每天上午8:00～9:00藥浴40min，藥浴水溫在9～11℃之間。各消毒劑設(shè)1個空白對照和5個濃度梯度，每個梯度設(shè) 3個平行。過氧化氫溶液：0mg/L、500mg/L、800mg/L、1000mg/L、1200mg/L；甲醛溶液：0mg/L、500mg/L、1000mg/L、1500mg/L、2000mg/L；聚維酮碘溶液：0mg/L、50mg/L、100mg/L、150mg/L、200mg/L；中草藥浸提液：0mL、20mL、50mL、80mL、100mL。

當受精后累積溫度達到100℃時檢測受精率[1]。待發(fā)眼后停止消毒，挑出死卵。采用重量法統(tǒng)計發(fā)眼率和孵化率，直接計數(shù)畸形率。

然后，根據(jù)上述試驗結(jié)果設(shè)計消毒劑兩兩交替使用試驗，前期使用的消毒劑標為A，后期使用消毒劑的標為B。A使用5d、7d、10d三個梯度，之后至發(fā)眼前使用B（表1）。

1.3 數(shù)據(jù)處理

使用SPSS 21.0統(tǒng)計分析軟件處理數(shù)據(jù)，根據(jù)以下公式計算各百分比：

表1 消毒劑搭配方案與使用時長Tab.1 Collocation scheme and usage period of various disinfectants in the experiments

2 結(jié)果與分析

2.1 各消毒劑對受精卵的影響

由表2可知，各劑量過氧化氫、甲醛和中草藥組受精卵的發(fā)眼率均極顯著高于空白對照組（P＜0.01）；聚維酮碘中僅有50mg/L組的發(fā)眼率顯著高于空白對照組（P＜0.05），100 mg/L試驗組極顯著高于空白對照組（P＜0.01）；除聚維酮碘150mg/L、200mg/L試驗組外，其他各試驗組的孵化率與空白對照組的差異均不顯著（P＞0.05）；過氧化氫、甲醛和中草藥組的畸形率與空白對照組間無顯著性差異（P＞0.05），聚維酮碘50mg/L以上劑量試驗組的畸形率均極顯著高于空白對照組（P＜0.01）。

2.2 不同消毒劑組合對虹鱒受精卵的影響

由表2可知：各藥浴濃度聚維酮碘受精卵的發(fā)眼率均極顯著低于其他三種消毒劑（P＜0.01），但畸形率均極顯著或顯著高于空白對照組和其他三種消毒劑（P＜0.01或P＜0.05）。對這三種消毒劑分別與發(fā)眼率、孵化率和畸形率之間的雙變量雙側(cè)T檢驗結(jié)果表明：不同藥浴劑量與發(fā)眼率之間存在著極顯著相關(guān)性，而與孵化率、畸形率之間不存在顯著相關(guān)性。因此，后續(xù)試驗中所使用的消毒劑種類和劑量分別為：過氧化氫溶液1 000mg/L、甲醛溶液1 500 mg/L、中草藥浸液50mL；在不同消毒劑組合試驗中僅對發(fā)眼率進行統(tǒng)計。

表2 各消毒劑對虹鱒受精卵的影響Tab.2 Influence of the disinfectants on fertilized eggs of rainbow trout

由表3可知：虹鱒受精卵經(jīng)六組不同消毒劑組合處理后，使用5d消毒劑A情況下，6組的發(fā)眼率之間無顯著性差異（P＞0.05）；使用7d消毒劑A情況下，第三組（甲醛+過氧化氫）的發(fā)眼率極顯著高于第五組（中草藥+過氧化氫）和第六組（中草藥+甲醛）（P＜0.01），顯著高于第二組（過氧化氫+中草藥）（P＜0.05）；使用10d消毒劑A情況下，第三組（甲醛+過氧化氫）和第四組（甲醛+中草藥）的發(fā)眼率極顯著或顯著高于第五組（中草藥+過氧化氫）和第六組（中草藥+甲醛）（P＜0.01或P＜0.05）；5d和10d的發(fā)眼率之間無顯著性差異（P＞0.05）。再對A使用時長與各組間進行雙變量雙側(cè)T檢驗，結(jié)果顯示：7d、10d情況下，兩者間具有顯著的相關(guān)性（P＜0.05）。

表3 不同組合消毒劑對虹鱒受精卵發(fā)眼率的影響Tab.3 Influences of different disinfectants combination on eyed embryo rate of fertilized eggs in rainbow trout

3 討論

3.1 四種消毒劑對虹鱒受精卵水霉的抑制作用

從受精卵至魚苗孵出，常以受精卵的發(fā)眼率、孵化率和畸形率來綜合評價虹鱒的孵化效果。水霉菌為孵化期間常感染的病菌，顯著影響虹鱒受精卵孵化的成活率。因此，常用控制受精卵水霉菌的效果來評估消毒劑的抑菌效果。

水霉為具有一定真菌特征而非真菌的類真菌生物[9-12]，防治難度很大。本試驗選擇目前生產(chǎn)者最常用的四種消毒劑處理受精卵。結(jié)果表明，過氧化氫、甲醛和中草藥三種消毒劑在各藥浴濃度下，受精卵的發(fā)眼率均極顯著或顯著高于對照組，說明這三種消毒劑對水霉均具有抑制效果用。然而所有濃度下的孵化率之間無顯著差異，這與國外眾多學者的研究結(jié)果相近[13-15]。而各研究結(jié)果的最佳藥浴濃度略不相同。本研究表明：各藥物的最佳藥浴濃度分別為：過氧化氫溶液1000mg/L、甲醛溶液1 500 mg/L、中草藥浸液50mL。其主要原因是：各試驗的藥浴水溫不同，水霉的滋生情況即不同；樣本數(shù)量也有所差異；親本健康程度亦影響受精卵的質(zhì)量、受精率和抗病力等。

本試驗發(fā)現(xiàn)，用聚維酮碘時，發(fā)眼率極顯著低于其他三種消毒劑，畸形率極顯著高于對照組。因此認為，聚維酮碘不適于防治虹鱒受精卵的水霉菌病。

3.2 四種消毒劑對虹鱒受精卵的毒性

試驗或生產(chǎn)中常以孵化率和畸形率作為衡量所使用藥物對受精卵毒性的標準。本試驗表明：過氧化氫、甲醛和中草藥組的畸形率與對照組無顯著性差異；150～200mg/L的聚維酮碘下孵化率顯著低于對照組和其他試驗組，而畸形率極顯著高于對照組，說明高濃度聚維酮碘對虹鱒受精卵具有明顯致畸影響，過氧化氫和中草藥無毒副作用，這與一些研究結(jié)果相似[16,17]。甲醛預(yù)防虹鱒受精卵水霉菌的效果毋庸置疑，但存在對作業(yè)人員健康有害、易在魚體內(nèi)殘留、影響水域環(huán)境等危害，在日本等國家已限制使用[18]。因此，篩選有效防治水霉菌的消毒劑，建立水霉菌防疫體系是目前研究的重點。

本試驗確定的過氧化氫、甲醛和本中草藥聯(lián)合使用方法，可避免盲目加大消毒劑用量而導致的畸形率增高。正確使用這些方法，不僅能提高虹鱒受精卵的發(fā)眼率和成活率，降低畸形率，且后期仔魚能安全、健康和快速生長。

3.3 不同組合消毒劑對虹鱒發(fā)眼率的影響

孵化期間，死卵極易滋生水霉。在水溫10℃下，一般4d后就開始著生水霉，伸出銀白色菌絲將鄰近健康卵包圍起來，使其窒息死亡。本試驗中，前期使用A消毒劑的時間超過4d，最低梯度定為5d。而一般測定受精率的時間為積溫達到100℃時，當溫度為10℃時，即10d，因此最高梯度定為10d。本試驗首次突破虹鱒卵從授精到發(fā)眼過程中使用單一藥物的消毒殺菌的習慣，將不同消毒劑組合起來使用，且設(shè)定了不同使用時長梯度。

受精卵經(jīng)六組不同組合處理后，前期使用5d消毒劑A梯度下，六組的發(fā)眼率之間無顯著性差異。使用7d消毒劑梯度下，第三組（甲醛+過氧化氫）的發(fā)眼率極顯著高于第五組（中草藥+過氧化氫）和第六組（中草藥+甲醛）；顯著高于第二組（過氧化氫+中草藥）。使用10d消毒劑A梯度下，第三組（甲醛+過氧化氫）和第四組（甲醛+中草藥）的發(fā)眼率極顯著或顯著高于第五組（中草藥+過氧化氫）和第六組（中草藥+甲醛）；雙側(cè)T檢驗的結(jié)果顯示：7d、10d情況下，A使用時長與發(fā)眼率顯著相關(guān)。綜合分析推測，虹鱒受精卵孵化前5d內(nèi)為水霉預(yù)防關(guān)鍵期，過氧化氫、甲醛和中草藥三種消毒劑的防御效果均較佳；5d后至發(fā)眼前，主要是水霉治療期，三種消毒劑的效果不同，甲醛的效果好于其他兩種。中草藥后期的治療效果較前期預(yù)防效果差，其主要原因是：本試驗所用中草藥為自制配方，成分仍有較大改進空間，且使用一般藥品時，預(yù)防所用劑量小于治療劑量，在后期治療中適當加大使用劑量可改善治療效果。5d與10d的發(fā)眼率無顯著差異，表明在養(yǎng)殖過程中預(yù)防疾病重于治療。

3.4 建議

本試驗表明，過氧化氫、甲醛和中草藥浸提液均可以顯著提高虹鱒受精卵的發(fā)眼率。然而，前兩種的使用劑量和頻率均較高，既加大了生產(chǎn)成本，又加重了操作人員的工作量，對人體健康也不利。近年來中草藥在水產(chǎn)動物疾病防治中的研究崛起，但中草藥成分復(fù)雜，有效成分直接合成及大量生產(chǎn)難度很大。本研究首次將不同藥物配合使用的，取得了較佳的效果。此方法在其他水產(chǎn)養(yǎng)殖動物疾病防治中已有使用，如將中草藥提取物與硫酸銅等復(fù)合使用后可有效抑制水霉屬和絲囊霉屬的生長，提高了異育銀鯽Carassius auratus gibelio和加州鱸Micropterus salmoides的出苗率[19]。建議在實際生產(chǎn)中，使用消毒劑與完善防疫體系并舉[20]，建立一套科學、嚴格、有效的防疫體系，可大大減少消毒劑的使用量，真正達到安全、高效、價廉。

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