論文：對(duì)蝦弧菌病的研究進(jìn)展

        對(duì)蝦弧菌病的研究進(jìn)展

呂莉，朱志東，鄧劍壕，馮豆，蔡延渠，朱宇嘉，朱盛山

（廣東藥科大學(xué)中藥開(kāi)發(fā)研究所，廣東 廣州 510006）

弧菌科Vibrionaceae細(xì)菌菌體短小，直或彎曲，是近海河口微生物區(qū)系中的革蘭氏陰性菌，廣泛分布于半咸水、河口、海洋的水體和沉積物中[1]。由弧菌引起的疾病，流行面積廣，發(fā)病率高，給對(duì)蝦養(yǎng)殖業(yè)造成了巨大危害[2]?；【。╒ibriosis）的診斷和防治一直受到國(guó)內(nèi)外對(duì)蝦養(yǎng)殖工作者的密切關(guān)注。目前，國(guó)內(nèi)外已報(bào)道的弧菌主要有副溶血弧菌Vibrio prarhaemolyticus、創(chuàng)傷弧菌 V.vulnificus、哈維氏弧菌 V.harveyi、溶藻弧菌 V.alginolyticus、鰻弧菌 V.anguillarium和霍亂弧菌V.cholerae等[3]。本文主要綜述對(duì)蝦感染弧菌病的癥狀、不同種弧菌的鑒定和弧菌病的防治，以期為對(duì)蝦弧菌病的診斷和防治提供參考。

1 診斷

1.1 弧菌病癥狀

患弧菌病對(duì)蝦一般表現(xiàn)為攝食減少，活動(dòng)減弱，行為異常，如在池邊淺水處不規(guī)則游動(dòng)、呆滯或沉底不動(dòng)等；出現(xiàn)不同體征，如紅腿、紅體、黃鰓、黑鰓、爛鰓、爛眼、體表甲殼有黑斑等；臨床癥狀如肌肉白濁、空腸空胃、肝胰腺不同程度的損傷、血液長(zhǎng)時(shí)間不能凝固等。鄧歡等[4]報(bào)道感染鰻弧菌的對(duì)蝦鰓發(fā)黃，有時(shí)鰓中還出現(xiàn)沉積物,鰓絲變脆弱,最終鰓絲不同程度地糜爛。陳月忠等[5]報(bào)道，感染哈維氏弧菌的對(duì)蝦活力減弱，不攝食，斷須，紅腿，黃鰓，腹部肌肉漸至全身白濁，在暗光背景下局部或全身發(fā)光。陳強(qiáng)等[6]報(bào)道，感染溶藻弧菌的對(duì)蝦甲殼有白斑、黑斑，黑鰓，頭胸甲易剝離。張彬等[7]報(bào)道，感染創(chuàng)傷弧菌對(duì)蝦蝦苗肝胰腺顏色變淡，部分萎縮，空腸空胃，有些腹節(jié)肌肉略微白濁。

1.2 回歸感染試驗(yàn)與弧菌鑒定

1.2.1 副溶血弧菌

1.2.1.1 回歸感染試驗(yàn)

樊景鳳等[8]取紅腿病蝦肌肉組織在TCBS培養(yǎng)基上劃線數(shù)次分離純化出一株優(yōu)勢(shì)菌，制成濃度為1.2×109cfu/mL的菌懸液，給健康凡納濱對(duì)蝦Litopenaeus vannamei腹部注射0.1mL/尾。藺紅蘋(píng)等[9]取紅體病蝦肝胰腺組織勻漿液在TCBS培養(yǎng)基上分離純化出一株優(yōu)勢(shì)菌，使養(yǎng)殖箱水中的含菌量達(dá)1.0×108cfu/mL，浸泡感染健康凡納濱對(duì)蝦后，癥狀與感染副溶血弧菌自然發(fā)病的癥狀相似。

1.2.1.2 弧菌鑒定

樊景鳳等[8]通過(guò)革蘭氏染色、生理生化和16S rRNA基因序列同源性分析，顯示從上述紅體病蝦中分離的病原菌株與副溶血弧菌顏色相似；不能在0%或10%NaCl胨水中生長(zhǎng)，接觸酶試驗(yàn)陽(yáng)性、葡萄糖磷酸鹽胨水反應(yīng)（V-P）陰性；基因序列長(zhǎng)度為570bp，與副溶血弧菌的同源性最高，達(dá)99%，鑒定為副溶血弧菌。藺紅蘋(píng)等[9]也顯示該菌株不能在0%或10%NaCl胨水中生長(zhǎng)，接觸酶試驗(yàn)、動(dòng)力試驗(yàn)均陽(yáng)性，V-P陰性，鑒定為副溶血弧菌。

1.2.2 哈維氏弧菌

1.2.2.1 回歸感染試驗(yàn)

蘇杭[10]取黃鰓、紅腿瀕死的凡納濱對(duì)蝦的白濁色肌肉和肝胰腺劃線接種于LBN培養(yǎng)基上培養(yǎng)，分離純化得到2株優(yōu)勢(shì)菌，制成濃度為3.2×105cfu/mL菌懸液，對(duì)健康凡納濱對(duì)蝦腹肌肉注射50μL/尾人工感染；黃海洪[11]取鰓絲、附肢等部位出現(xiàn)綠色熒光的凡納濱對(duì)蝦的肝胰腺勻漿，在TCBS平板上劃線培養(yǎng)分離數(shù)次純化得3株優(yōu)勢(shì)菌，制成不同濃度的菌懸液注射感染，感染后凡納濱對(duì)蝦病癥與感染哈維氏弧菌自然發(fā)病的病癥相似。

1.2.2.2 弧菌鑒定

蘇杭[10]通過(guò)TCBS培養(yǎng)基培養(yǎng)、革蘭氏染色及電鏡下形態(tài)觀察、生理生化試驗(yàn)和16S rRNA基因序列同源性分析，顯示從病蝦中分離的兩菌株不能在42℃或0%NaCl胨水中生長(zhǎng)，明膠酶試驗(yàn)為陽(yáng)性，精氨酸脫羧酶、鳥(niǎo)氨酸脫羧酶、賴氨酸脫羧酶試驗(yàn)、V-P均為陰性；同源性相似度達(dá)99%的有100個(gè)序列，其中與哈維氏弧菌菌株序列相似的有30個(gè)序列，與哈維氏弧菌聚類為一支，鑒定為哈維氏弧菌。黃海洪[11]采用類似分析顯示，上述病蝦中分離的3株病原菌均呈綠色，有熒光；賴氨酸脫羧酶試驗(yàn)、吲哚產(chǎn)生試驗(yàn)、明膠酶試驗(yàn)均為陽(yáng)性，精氨酸雙水解酶試驗(yàn)、鳥(niǎo)氨酸脫羧酶試驗(yàn)、色氨酸脫羧酶試驗(yàn)均為陰性；與創(chuàng)傷弧菌的相似度最高，與哈維氏弧菌聚類為一支，鑒定為哈維氏弧菌。

1.2.3 鰻弧菌

1.2.3.1 回歸感染試驗(yàn)

鄭國(guó)興等[12]用滅菌針筒作紅腿病蝦的心臟穿刺，抽取淋巴液，接種于含有2%NaCl的營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板上培養(yǎng)，分離純化獲得優(yōu)勢(shì)菌，制成菌懸液肌肉注射感染健康對(duì)蝦，感染后癥狀與感染鰻弧菌自然發(fā)病蝦的癥狀相似。

1.2.3.2 弧菌鑒定

鄭國(guó)興等[12]從病蝦中分離的病原菌在TCBS培養(yǎng)基培養(yǎng)不生長(zhǎng)；生理生化培養(yǎng)顯示該菌不能在42℃、0%和8%NaCl胨水中生長(zhǎng)，精氨酸脫羧酶試驗(yàn)、V-P試驗(yàn)均陽(yáng)性，鳥(niǎo)氨酸脫羧酶、賴氨酸脫羧酶試驗(yàn)和吲哚產(chǎn)生試驗(yàn)均陰性，對(duì)弧菌抑制劑O/129敏感，鑒定為鰻弧菌。

1.2.4 霍亂弧菌

1.2.4.1 回歸感染試驗(yàn)

鄭國(guó)興[13]從爛眼病蝦眼球中分離得8株純化菌，制成1 012個(gè)/mL的懸液。將健康中國(guó)對(duì)蝦Fenneropenaeus chinensis浸泡在每L海水加0.2mL懸液的水中感染；王立平等[14]取腸道腫脹病蝦幼體勻漿在海水營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板劃線培養(yǎng)，分離純化出5株菌，制成菌懸液浸泡和肌注感染健康幼蝦；曹海鵬等[15]對(duì)從患白便綜合征的凡納濱對(duì)蝦肝胰腺中分離純化得一株優(yōu)勢(shì)菌，以菌餌的菌濃度為1.0×108CFU/g，每日按蝦總體重的2%投喂感染健康蝦。上述方法感染后的對(duì)蝦病癥均與感染霍亂弧菌自然發(fā)病對(duì)蝦的病癥相似。

1.2.4.2 弧菌鑒定

鄭國(guó)興[13]將從上述病蝦中分離的8株病原菌進(jìn)行生化鑒定，顯示8株純化菌生物學(xué)性狀基本相同，能在42℃或0%NaCl胨水中生長(zhǎng)，不能在5%和7%NaCl胨水中生長(zhǎng)，賴氨酸脫羧酶陽(yáng)性，精氨酸、鳥(niǎo)氨酸脫羧酶試驗(yàn)均陰性，對(duì)弧菌抑制劑O/129敏感，鑒定為霍亂弧菌。王立平等[14]對(duì)上述病蝦中分離的5株病原菌進(jìn)行鑒定，顯示基本相同的生物學(xué)性狀，也鑒定均為霍亂弧菌。曹海鵬等[15]將上述病蝦中分離的病原菌用API20E革蘭陰性菌鑒定系統(tǒng)進(jìn)行鑒定和16S rRNA基因序列同源性分析，顯示該菌鳥(niǎo)氨酸試驗(yàn)陽(yáng)性，精氨酸、賴氨酸陰性；16S rRNA序列與GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中弧菌屬菌株的16S rRNA基因序列的同源性高達(dá)99%～100%，與霍亂弧菌菌株RD1的親緣性最近，鑒定為霍亂弧菌。

1.2.5 創(chuàng)傷弧菌

張彬等[7]取患空腸空胃病蝦苗勻漿，離心，取上清液以生理鹽水稀釋，在TCBS培養(yǎng)基上分離、純化得一株優(yōu)勢(shì)菌。經(jīng)TCBS培養(yǎng)基培養(yǎng)、革蘭氏染色、生理生化和16S rRNA基因序列同源性分析，顯示該菌株菌落呈黃色；鳥(niǎo)氨酸脫羧酶、賴氨酸脫羧酶等呈陰性反應(yīng)，對(duì)弧菌抑制劑O/129敏感；與創(chuàng)傷弧菌（JQ307112.1）的相似度最高，同源性為98.0%，鑒定為創(chuàng)傷弧菌。

1.2.6 溶藻弧菌

鄔長(zhǎng)祥[16]從患病凡納濱對(duì)蝦鰓及腸勻漿中分離得到純化菌，經(jīng)TCBS培養(yǎng)基培養(yǎng)、溶藻弧菌生化鑒定和16S rRNA基因序列同源性分析，菌落不能在0%NaCl胨水中生長(zhǎng)，能在42℃和7%、10%Na-Cl胨水中生長(zhǎng)，動(dòng)力試驗(yàn)為陽(yáng)性；與溶藻弧菌的相似性為99%，擴(kuò)增出特異性目的條帶，鑒定為溶藻弧菌。

2 抑菌試驗(yàn)研究

2.1 抗生素類

張曉君等[17]采用常規(guī)瓊脂擴(kuò)散（K-B）法測(cè)定了副溶血弧菌對(duì)49種常用抗生素的藥物敏感性。結(jié)果表明，副溶血弧菌對(duì)環(huán)丙沙星最敏感；對(duì)林可霉素、苯唑青霉素、新生霉素、萬(wàn)古霉素、麥迪霉素、阿莫西林均耐藥。趙典惠[18]等采用紙片瓊脂擴(kuò)散法測(cè)定了創(chuàng)傷弧菌TO-3對(duì)44種常用抗生素的藥物敏感性。結(jié)果表明，創(chuàng)傷弧菌TO-3對(duì)左氟沙星最敏感。姬華[19]采用微量肉湯稀釋法測(cè)定了169株創(chuàng)傷弧菌對(duì)12種抗菌藥的敏感性，發(fā)現(xiàn)左旋氧氟沙星的抑菌效果最明顯，最小抑菌濃度（minimal inhibitory concentration，MIC）≤0.05μg/mL，阿米卡星的抑菌效果最不明顯，MIC為16μg/mL。蘇杭[10]用倍比稀釋法測(cè)定了6種抗生素對(duì)從病蝦中分離到的哈維氏弧菌的最小抑菌濃度。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，鹽酸恩諾沙星最低，MIC為0.25μg/mL；甲砜霉素最高，MIC為64μg/mL。趙魯寧等[20]用ATB藥敏檢測(cè)系統(tǒng)檢測(cè)了31株鰻弧菌對(duì)28種抗生素的敏感性。結(jié)果顯示菌株對(duì)林可霉素、夫西地酸、甲硝唑、阿莫西林、阿莫西林/克拉維酸、苯唑西林和青霉素的耐藥率為100%，對(duì)紅霉素、原始霉素、泰洛星的耐藥率為94.4%，有83%以上的菌株對(duì)12種以上的抗生素具有耐藥性。

2.2 中草藥

趙典惠等[18]用紙片瓊脂擴(kuò)散法測(cè)定了創(chuàng)傷弧菌TO-3對(duì)17味中草藥的敏感性，對(duì)五倍子和訶子最敏感；大黃最不敏感，并采用96孔板倍比稀釋法測(cè)定了五倍子、訶子和大黃對(duì)創(chuàng)傷弧菌TO-3的MIC和最小殺菌濃度（MBC）。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，五倍子的MIC和MBC分別為0.049 mg/mL、0.098mg/mL，訶子的MIC和MBC為0.195313 mg/mL；而大黃的MIC和MBC均為1.56 mg/mL。閆茂倉(cāng)等[21]用倍比稀釋法測(cè)定了22味中草藥對(duì)創(chuàng)傷弧菌的MIC和MBC，黃連的抑菌和殺菌效果最好，MIC和MBC均為0.49mg/mL，其次為連翹，MIC和MBC均為1.95 mg/mL。張曉君[22]用瓊脂擴(kuò)散法（打孔法）測(cè)定了哈維氏弧菌對(duì)20種中草藥的藥物敏感性，蘇木最為敏感，五倍子次之；而桑葉、金銀花等的抑菌作用最不明顯；二倍稀釋法測(cè)定表明，五倍子的MIC和MBC均小于0.195 mg/mL；蘇木的MIC和MBC均為25 mg/mL；桑葉和金銀花MIC均在100 mg/mL。鄭天倫等[23]測(cè)定了15種中草藥對(duì)溶藻弧菌的MIC和MBC，石榴皮和地榆的抑菌和殺菌效果最好，MIC和MBC分別為1.56和6.25 g/L；地丁和威靈仙抑菌效果最不明顯，MIC均為100g/L。張明等[24]采用試管連續(xù)倍比稀釋法研究發(fā)現(xiàn)，大黃的抑菌作用最明顯，MIC和MBC分別為0.25和25 mg/mL；白頭翁、魚(yú)腥草的醇提物和五倍子、石榴皮的水提物的MIC均為3.125 mg/mL；而博落回、白頭翁、五倍子、石榴皮、黃芩的殺菌作用較其他植物提取物顯著，MBC均為6.25mg/mL。王玉娥等[25]采用倍比稀釋法測(cè)定了10種中草藥對(duì)副溶血弧菌、哈維氏弧菌、溶藻弧菌、河流弧菌Vibrio fluvialis和麥?zhǔn)匣【鶹.metschnikovii的MIC和MBC，其中五倍子效果最佳，對(duì)副溶血、溶藻、河流、麥?zhǔn)匣【腗IC和MBC均為1.56mg/mL，對(duì)哈維氏弧菌的MIC和MBC均為3.125mg/mL；其次為黃連，對(duì)溶藻、河流、麥?zhǔn)匣【腗IC和MBC分別為3.125和6.25 mg/mL，對(duì)哈維氏、副溶血弧菌的MIC和MBC分別為6.25和12.5 mg/mL。梁利國(guó)等[26]采用試管連續(xù)稀釋法測(cè)定了五倍子等7種中草藥對(duì)副溶血、河口、霍亂弧菌和鰻弧菌的MIC和MBC，其中蘇木、五倍子、地錦草和石榴皮4種中藥具有較好的抑菌和殺菌作用，對(duì)鰻弧菌、副溶血弧菌、河口弧菌及霍亂弧菌等4種病原弧菌的MIC為0.78～6.25 mg/mL，MBC為3.12～12.5 mg/mL。周澤琴等[27]采用微量肉湯稀釋法測(cè)定了NZ中藥復(fù)方和12種水產(chǎn)養(yǎng)殖常用的抗菌中藥產(chǎn)品對(duì)4株弧菌（副溶血、創(chuàng)傷、哈維氏、溶藻弧菌）的MIC，結(jié)果NZ方與市售“蝦倍健”抑菌效果最佳，對(duì)4株弧菌的MIC在0.313～1.250g/L之間，其他市售中藥MIC均大于40.00g/L。

3 臨床試驗(yàn)研究

3.1 中草藥防治

王蕓等[28]將由黃芪、大黃、甘草和黃芩等比例組成的復(fù)方中草藥按1%的劑量添加到飼料中，連續(xù)投喂凡納濱對(duì)蝦12d，停藥16d后每尾注射50μL的1×108cells/mL副溶血弧菌液，感染對(duì)蝦的7d累積死亡率（6.7%）顯著低于對(duì)照組（80%）。

3.2 微生物防治

藺紅蘋(píng)等[29]在水中加入副溶血弧菌菌液，水體含菌量達(dá)1×108個(gè)/mL，浸泡感染凡納濱對(duì)蝦，再分別加 0 pfu/mL、1×106pfu/mL、1×105pfu/mL和 1×104pfu/mL的噬菌體，死亡率分別是58%、8%、17%和33%。周鮮嬌等[30]在副溶血弧菌終濃度達(dá)2.5×107cfu/mL水中浸泡感染凡納濱對(duì)蝦1d后，一組加入副溶血弧菌噬菌體（終濃度達(dá)1.0×106pfu/mL）浸泡，另一組用每克含噬菌體1×109pfu的飼料投喂，以不加噬菌體為對(duì)照，9d的死亡率分別為6.25%、6.25%和18.75%。

3.3 免疫防治

曹劍香等[31]以每克飼料含疫苗細(xì)胞1.0×109、1.0×108、1.0×107個(gè)的溶藻弧菌疫苗飼料和不含疫苗細(xì)胞的普通飼料投喂凡納濱對(duì)蝦，30d后每組對(duì)蝦肌注1.4×107cfu/mL的溶藻弧菌0.1mL/尾，進(jìn)行人工感染，15d的免疫保護(hù)率分別為66.7%、46.7%、13.3%和0。李海兵[32]分別給健康中國(guó)對(duì)蝦注射50μL鰻弧菌疫苗、鰻弧菌的牙鲆抗血清和生理鹽水，飼養(yǎng)一周后再分別給每組對(duì)蝦每尾注射50μL 104cfu/mL的復(fù)狀鰻弧菌進(jìn)行感染。結(jié)果注射鰻弧菌疫苗、抗體和對(duì)照組對(duì)蝦的累計(jì)死亡率分別為25.82%、9.09%和46.5%。朱香萍等[33]分別給對(duì)蝦投喂含1%鰻弧菌卵黃抗體（IgY）和普通卵黃的飼料，并在第二腹節(jié)側(cè)面注射含活菌數(shù)約為108個(gè)/mL的鰻弧菌菌液30μL/尾，進(jìn)行人工感染，7d內(nèi)試驗(yàn)組和對(duì)照組對(duì)蝦的死亡率分別為15%和60%。

4 討論

弧菌病是魚(yú)蝦養(yǎng)殖中最為嚴(yán)重的病害之一，嚴(yán)重限制了行業(yè)的發(fā)展[34]。防治蝦弧菌病，早期診斷至關(guān)重要。對(duì)蝦弧菌病的診斷一般靠初期癥狀來(lái)判斷和從病蝦中分離純化出優(yōu)勢(shì)菌的回歸感染試驗(yàn)。證實(shí)該優(yōu)勢(shì)菌是病原菌后，通過(guò)TCBS培養(yǎng)特征、革蘭氏染色形態(tài)、生理生化和分子生物技術(shù)鑒定為何種弧菌。但是，生理生化檢測(cè)的指標(biāo)不一，沒(méi)有統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)，衡量指標(biāo)還有待討論。分子生物技術(shù)已廣泛應(yīng)用于水產(chǎn)弧菌的檢測(cè)，如PCR技術(shù)具有較強(qiáng)的靈敏度、準(zhǔn)確度和特異性，對(duì)快速診斷弧菌具有重要意義。

防治對(duì)蝦弧菌病多用抗生素、中草藥、微生物和免疫方法?？股匾讱埩簟⒛退帲蟛糠直涣袨樗a(chǎn)養(yǎng)殖禁藥；免疫防治雖展現(xiàn)出潛在的效果，但疫苗制備過(guò)程復(fù)雜，免疫效果受多種因素（如抗原的種類和性質(zhì)、被免疫蝦的規(guī)格、投放方法以及環(huán)境因素等）的影響[35]；微生物制劑如噬菌體面臨產(chǎn)生抗性、安全性等問(wèn)題[36]；中草藥安全無(wú)殘留、無(wú)耐藥性、天然綠色、資源豐富，對(duì)弧菌的體外抑菌效果良好，如中藥復(fù)方NZ方，對(duì)4株弧菌有效，MIC在0.313～1.250g/L，能明顯降低患弧菌病對(duì)蝦的死亡率。

中草藥抑菌試驗(yàn)的結(jié)果重復(fù)性較差，MIC結(jié)果相差很大，甚至達(dá)16倍[22,25]。推測(cè)可能有以下幾個(gè)原因：一是試驗(yàn)菌種型號(hào)和菌種活力，研究者選取的病原弧菌，有的分離自病蝦，有的分離自病魚(yú)或病死泥鰍Misgurnus anguillicaudatus[23,26]，菌種型號(hào)不一樣，有的研究對(duì)冰箱中保存的菌種進(jìn)行菌種復(fù)蘇培養(yǎng)以保證菌種活力[27]；二是選取的中藥材本身的影響，中藥材因產(chǎn)地、氣候、采收季節(jié)不同，同一藥材成分差別很大[37]，同時(shí)選取的藥材部位[38]、炮制加工方法、貯藏運(yùn)輸方法等[39,40]均會(huì)影響同一藥材成分含量，中草藥藥液的制備工藝如藥材粉碎目數(shù)、提取溶劑種類及體積、濃縮時(shí)間等均可能影響中藥材成分含量[41-43]，這些均有待探究。