論文：柱形病對黃顙魚血液生化指標的影響

柱形病對黃顙魚血液生化指標的影響

程輝輝,李大鵬

(華中農(nóng)業(yè)大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院，池塘健康養(yǎng)殖湖北省工程實驗室，淡水水產(chǎn)健康養(yǎng)殖湖北省協(xié)同創(chuàng)新中心，

農(nóng)業(yè)部淡水生物繁育重點實驗室，武漢430070)

摘要：為探究柱形病對黃顙魚(Pelteobagrus fulvidraco)生理機能的影響，隨機選取患病和健康黃顙魚各10尾，采集其血液，靜置后離心分離血清以測定血液生化指標如皮質(zhì)醇、乳酸(LD)含量，乳酸脫氫酶(LDH)、堿性磷酸酶(ALP)活性，葡萄糖、白蛋白(ALB)、總蛋白(TP)、尿素氮(BUN)、總膽固醇(TCHO)、高密度脂蛋白膽固醇(HDLC)、低密度脂蛋白膽固醇(LDLC)含量，谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)活性。結(jié)果顯示：患病黃顙魚血清皮質(zhì)醇濃度和LDH、AST活性均極顯著高于健康魚，LD含量和ALT活性顯著高于健康魚。與健康魚相比，患病黃顙魚血清葡萄糖含量極顯著降低，而HDLC、LDLC、TCHO、ALB、TP、BUN濃度和ALP活性無顯著差異。健康魚肝細胞呈近圓形，形狀較規(guī)則，細胞界線清晰，細胞核多位于細胞中央，呈圓形或橢圓形，肝細胞以中央靜脈為中心形成放射狀排列?；疾◆~肝細胞出現(xiàn)局部壞死、空泡化，形成壞死灶,伴有大量中性粒細胞、淋巴細胞浸潤。結(jié)果表明：柱狀黃桿菌感染可引起黃顙魚魚體顯著的應(yīng)激反應(yīng)，并引起魚體肝臟損傷。

關(guān)鍵詞：黃顙魚(Pelteobagrus fulvidraco);柱形病;生化指標;皮質(zhì)醇;肝臟組織

黃顙魚(Pelteobagrusfulvidraco)隸屬于鲇形目鮠科黃顙魚屬，廣泛分布于在我國長江、珠江、黑龍江流域江河湖泊等水域，為我國名特經(jīng)濟魚類之一。在黃顙魚人工養(yǎng)殖過程中，由于養(yǎng)殖環(huán)境惡化等原因，黃顙魚病害時有發(fā)生[1]，常見有錨頭鳋病、細管蟲病、車輪蟲病等[2]寄生蟲性疾病以及出血性水腫病、腸炎病、爛鰓病[3]等細菌性疾病。

1材料與方法

1.1實驗魚

黃顙魚來源于湖北省公安縣崇湖漁場，暫養(yǎng)于華中農(nóng)業(yè)大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院教學(xué)實習(xí)基地人工生態(tài)試驗系統(tǒng)養(yǎng)殖缸內(nèi)，暫養(yǎng)期間部分黃顙魚自然感染柱狀黃桿菌而患病并出現(xiàn)死亡，當(dāng)時水溫為10～15 ℃。

1.2實驗方法

1.2.1采血和血清制備

隨機選取黃顙魚柱形病患病魚，體質(zhì)量為(112.13±31.13)g，體長(18.80±1.86)cm和健康魚，體質(zhì)量為(108.41±39.57)g，體長(18.67±2.68)cm，各10尾(患病和健康魚體質(zhì)量和體長均無顯著差異)，采用MS-222(160 mg/L)進行魚體麻醉，尾動脈采血1 mL左右，室溫靜置至血液分層后，1 500 r/min離心30 min分離血清用于血液生化指標的測定。

1.2.2血液生化指標的測定

血清皮質(zhì)醇濃度采用競爭性放射性免疫測定法測定，檢測試劑盒購自北京北方生物技術(shù)研究所。乳酸(LD)含量，乳酸脫氫酶(LDH)、堿性磷酸酶(ALP)活性均采用南京建成生物工程研究所試劑盒測定，相應(yīng)操作參照說明書進行。葡萄糖、白蛋白(ALB)、總蛋白(TP)、尿素氮(BUN)、總膽固醇(TCHO)、高密度脂蛋白膽固醇(HDLC)、低密度脂蛋白膽固醇(LDLC)含量，谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)活性指標均采用Chemix-800型全自動生化分析儀(日本希森美康公司)測定，相應(yīng)操作參照說明書進行。

1.2.3肝臟組織石蠟切片觀察

解剖黃顙魚柱形病患病和健康魚魚體，分離肝臟，采集肝臟樣品(大小為3 mm×3 mm×3 mm)于Bouin氏液固定24 h，普通石蠟(56 ℃)包埋、RN2135型切片機(德國Leica公司)連續(xù)切片(厚度5～6 μm)、H.E染色后，最后用80 i熒光顯微鏡(日本Nikon公司)觀察并拍照記錄。

1.3數(shù)據(jù)分析

使用SPSS 19.0軟件獨立樣本T檢驗對數(shù)據(jù)進行分析，數(shù)據(jù)以平均值±標準差形式表示，P<0.05為差異顯著，P<0.01 為差異極顯著。

2結(jié)果

2.1黃顙魚柱形病患病魚癥狀描述

患病黃顙魚除尾部背肌處皮膚斑塊狀褪色潰爛外，體色發(fā)黑，頭部尤為明顯；口腔、下頜和下頜至腹部粘附黃褐色物質(zhì)，將其刮落，可觀察到暴露出來的皮膚出現(xiàn)不同程度的腐爛；眼睛凹陷，體表黏液增多，但未見鰓絲腫脹糜爛等異常情況；少數(shù)病魚腹部胸鰭處出現(xiàn)明顯的破潰。瀕死黃顙魚離群獨游，行動緩慢，對外界刺激反應(yīng)遲鈍，偶見病魚旋轉(zhuǎn)翻滾。解剖魚體可見：癥狀輕微者，內(nèi)臟器官無明顯病變；癥狀嚴重者，腸壁變薄、腸道內(nèi)充滿黃色黏液，但未見腹水，其脂肪和肌肉組織也無出血現(xiàn)象。

2.2黃顙魚柱形病患病魚血液生化指標的變化

患病黃顙魚血清皮質(zhì)醇濃度和LDH、AST活性均極顯著高于健康魚，LD含量和ALT活性顯著高于健康魚。與健康魚相比，患病黃顙魚血清葡萄糖含量極顯著降低，而HDLC、LDLC、TCHO、ALB、TP、BUN濃度和ALP活性無顯著差異(表1)。

2.3黃顙魚柱形病患病魚肝臟組織石蠟切片的觀察

健康魚肝細胞呈近圓形，形狀較規(guī)則，細胞界線清晰，細胞核多位于細胞中央，呈圓形或橢圓形，肝細胞以中央靜脈為中心形成放射狀排列(圖1A)?；疾◆~肝細胞出現(xiàn)局部壞死、空泡化，形成壞死灶,伴有大量中性粒細胞、淋巴細胞浸潤(圖1B)。

表1　柱形病患病和健康黃顙魚血液生化指標比較

注：*表示差異顯著(P<0.05)， **表示差異顯著(P<0.01)，n表示重復(fù)數(shù)。# 表示由于患病黃顙魚處于瀕死狀態(tài)，采血困難，采血量不足，導(dǎo)致樣本數(shù)減少。

圖1　柱形病患病和健康黃顙魚肝臟組織石蠟切片觀察的比較

注：A，健康黃顙魚肝臟組織；B，患病黃顙魚肝臟組織。CV，中央靜脈；HC，肝細胞索；HS，肝竇；VD，空泡變性；LN，局部壞死。

3討論

皮質(zhì)醇通常作為魚類應(yīng)激的指示指標。當(dāng)魚類經(jīng)歷運輸、氨氮、酸堿等脅迫時，往往會表現(xiàn)出以血液皮質(zhì)醇濃度升高為代表的應(yīng)激反應(yīng)[5-7]。黃顙魚感染累枝蟲出現(xiàn)了以血液皮質(zhì)醇含量顯著升高為代表的應(yīng)激反應(yīng)[8]，而柱形病患病黃顙魚的血清皮質(zhì)醇濃度極顯著升高，同樣表明柱狀黃桿菌的感染引起了黃顙魚顯著的應(yīng)激反應(yīng)?？梢?，細菌與寄生蟲等一樣，均可被看作生物應(yīng)激因子[9-10]。魚類應(yīng)激反應(yīng)中，血糖含量往往也會明顯升高[5,11]，然而，非洲鯰魚(Clariasgariepinus)經(jīng)過72 h運輸應(yīng)激之后其血漿葡萄糖濃度仍保持穩(wěn)定[12]。但是本研究結(jié)果顯示患病黃顙魚血清葡萄糖含量極顯著降低，可能是由于葡萄糖作為二級應(yīng)激反應(yīng)指示指標，其濃度變化明顯滯后于皮質(zhì)醇[13]，導(dǎo)致患病黃顙魚低水平血糖水平未能及時補充。

乳酸主要是肌肉在供氧不足如水體中溶氧含量低、血液循環(huán)緩慢和動物的劇烈運動等情況下通過糖酵解產(chǎn)生。LDH活性為衡量無氧酵解能力的重要指標，是無氧代謝終產(chǎn)物L(fēng)D的直接催化酶。機體受脅迫后多會表現(xiàn)出劇烈運動，從而導(dǎo)致LD的累積[14-15]。患病黃顙魚血清LD含量極顯著高于健康魚，主要可能是在感染柱狀黃桿菌的初期，黃顙魚顯著的應(yīng)激反應(yīng)導(dǎo)致患病黃顙魚劇烈運動，短時間產(chǎn)生的LD沒有被充分清除而積累在體內(nèi)，進而引起LDH活性極顯著地升高。而在感染柱狀黃桿菌的后期，黃顙魚瀕臨死亡，反應(yīng)遲鈍，行動緩慢，實驗過程中偶見其旋轉(zhuǎn)翻滾。

HDLC和LDLC是反映脂類在動物體內(nèi)的分解、轉(zhuǎn)運及肝臟脂肪代謝的重要指標。TCHO是脂肪在血液中存在的一種形式，其主要在肝臟中合成，是反映肝臟對脂肪的代謝狀況的指標之一[16-17]。ALB、TP和BUN是反映血清蛋白質(zhì)代謝和排泄水平的重要指標[17-18]。患病黃顙魚血清HDLC、LDLC、TCHO、ALB、TP、BUN濃度無顯著差異表明，盡管柱狀黃桿菌引起的應(yīng)激導(dǎo)致黃顙魚葡萄糖和LD含量的顯著變化，但柱狀黃桿菌感染對黃顙魚脂類和蛋白質(zhì)代謝并無顯著影響。

AST主要分布于心肌，ALT主要分布于肝臟，都屬于胞內(nèi)功能酶，正常情況下血清中含量很低，但當(dāng)肝細胞或心肌細胞受損時，由于細胞膜通透性增加，胞漿內(nèi)的ALT與AST釋放入血漿，致使血清ALT和AST活性升高，因而具有重要的魚病診斷意義[19]。而ALP活性通常認為與肝功能障礙和肝臟疾病緊密相關(guān)[20]。柱狀黃桿菌多數(shù)危害魚類鰓部并引起魚體體表潰瘍[21]。黃琪琰等[22]對草魚人工感染魚害黏球菌(MyxococcuspiscicolaLu,Nie & Ko,1975)，發(fā)現(xiàn)草魚不僅鰓部發(fā)生嚴重病變，而且肝細胞發(fā)生顆粒變性、水樣變性、糖元顆粒消失，以至壞死；腎組織主要發(fā)生近曲小管上皮細胞顆粒變性、水樣變性、壞死。魚害黏球菌是柱狀黃桿菌的同物異名[23]，魚害黏球菌可引發(fā)魚類爛鰓病。本試驗中同樣發(fā)現(xiàn)黃顙魚肝臟空泡變性和局部壞死，但未觀察到鰓絲腫脹糜爛等異常情況?；疾↑S顙魚血清AST活性極顯著升高，ALT活性顯著升高，血液學(xué)指標顯示出患病黃顙魚肝臟損傷，而肝臟石蠟切片觀察到空泡變性和局部壞死則進一步說明柱狀黃桿菌引起黃顙魚肝臟損傷。

綜上所述，柱狀黃桿菌感染可引起黃顙魚魚體顯著的應(yīng)激反應(yīng)，并引起魚體肝臟損傷。

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