論文：高度耐藥嗜水氣單胞菌的定向誘導(dǎo)及其交叉耐藥性分析

高度耐藥嗜水氣單胞菌的定向誘導(dǎo)及其交叉耐藥性分析

張國(guó)亮1，呂利群1,2

(1.國(guó)家水生動(dòng)物病原庫(kù)，農(nóng)業(yè)部淡水水產(chǎn)種質(zhì)資源利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海海洋大學(xué)水產(chǎn)與生命學(xué)院，上海 201306;2.淡水水產(chǎn)健康養(yǎng)殖湖北省協(xié)同創(chuàng)新中心，武漢 430070)

為了分析比較不同抗生素對(duì)耐藥嗜水氣單胞菌(Aeromonashydrophila)的誘導(dǎo)效率，從五大類抗生素中各挑選出一種代表性的抗生素，在針對(duì)嗜水氣單胞菌菌株AH10的防耐藥突變濃度(mutant prevention concentration,MPC)的瓊脂平板上，分別篩選出五株耐藥菌株，并對(duì)篩選的耐藥菌株進(jìn)行交叉耐藥性分析，制定出這些耐藥菌株對(duì)常用抗生素的最小抑菌濃度(minimal inhibitory concentrations,MIC)圖譜。結(jié)果顯示:四環(huán)素、氟苯尼考、磺胺嘧啶、硫酸新霉素、諾氟沙星對(duì)AH10的MIC分別為：1.0、0.5、8.0、8.0、0.25 μg/mL;MPC分別為4.0、3.0、128、88、2.0 μg/mL，分離的耐藥菌株對(duì)所使用抗生素的MIC均提高100倍以上。4 ℃劃線平板冰箱保存條件下，一個(gè)月內(nèi)個(gè)別耐藥菌株耐藥性下降。在藥物篩選壓力下，菌株耐藥性隨著傳代次數(shù)增多而表現(xiàn)出遞增的趨勢(shì)。同屬一類抗生素耐藥相關(guān)性較高；不同大類抗生素壓力下篩選出來(lái)的耐藥菌株表現(xiàn)出不同的交叉耐藥性。

嗜水氣單胞菌(Aeromonashydrophila)；耐藥性；抗生素；交叉耐藥

由嗜水氣單胞菌(Aeromonashydrophila)引起的細(xì)菌性敗血癥是水產(chǎn)養(yǎng)殖中較嚴(yán)重的疾病之一。水產(chǎn)養(yǎng)殖中被廣泛應(yīng)用于治療敗血癥的抗生素有磺胺類、喹諾酮類、四環(huán)素類、酰胺類以及氨基糖苷類五大類。隨著各類抗生素應(yīng)用越來(lái)越廣泛，魚(yú)藥濫用、混用現(xiàn)象嚴(yán)重。加上缺乏相應(yīng)的規(guī)范性法律法規(guī)[1]，導(dǎo)致耐藥性問(wèn)題日趨嚴(yán)重，多重耐藥現(xiàn)象突出，給水產(chǎn)養(yǎng)殖病害防治帶來(lái)很大的困難。

李愛(ài)華等[1]對(duì)嗜水氣單胞菌耐藥性進(jìn)行了系統(tǒng)的研究，為研究多重耐藥性提供了依據(jù)。李煥榮等[2]對(duì)采集的嗜水氣單胞菌菌株進(jìn)行了藥物敏感性實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)耐藥現(xiàn)象較為嚴(yán)重，且耐藥性呈現(xiàn)增加的趨勢(shì)。Kaskhedikar等[3]發(fā)現(xiàn)采集到的嗜水氣單胞菌對(duì)青霉素產(chǎn)生的耐藥率達(dá)到了100%。朱芝秀等[4]發(fā)現(xiàn)從江西分離的嗜水氣單胞菌對(duì)不同抗生素均有耐藥性，耐藥率最高的達(dá)到94%。以上研究表明：嗜水氣單胞菌耐藥性在不同地區(qū)，不同年代略有差異，但總體偏高。耐藥性一但產(chǎn)生，很難消失，且會(huì)引起更為復(fù)雜的耐藥及多重耐藥機(jī)制，影響深遠(yuǎn)[5]。

為了解在長(zhǎng)期低劑量用藥情況下嗜水氣單胞菌的交叉耐藥性及耐藥變化情況，本研究從五大類抗生素中各挑選出一種代表性的抗生素，針對(duì)每種抗生素篩選出五株耐藥菌株，對(duì)其進(jìn)行最小抑菌濃度(MIC)圖譜測(cè)定，繪制交叉耐藥圖譜，從而對(duì)比其耐藥性及交叉耐藥性，為臨床用藥提供有力依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌株來(lái)源

本實(shí)驗(yàn)室從上海崇明某養(yǎng)殖場(chǎng)患典型嗜水氣單胞菌性敗血癥瀕死草魚(yú)體內(nèi)分離，鑒定后定名為嗜水氣單胞菌AH10，現(xiàn)保存于上海海洋大學(xué)國(guó)家水生動(dòng)物病原庫(kù)。

1.2 試劑

Muller-hinton(MH)培養(yǎng)基購(gòu)于北京陸橋科技有限公司；16S rDNA 引物由上海生工生物工程有限公司合成，27F：5′-AGAGTTTGATCATGGCTCAG-3′；1492R：5′-CTACGGTTACCTTGTTACGAC-3′。沙拉沙星購(gòu)于南京精瑞久安生物技術(shù)有限公司，純度為98%，批號(hào)為20131105；甲風(fēng)霉素購(gòu)于上海將來(lái)實(shí)業(yè)有限公司，純度為98.5%，批號(hào)為JL140822005；氧氟沙星(純度≥99%)、強(qiáng)力霉素(純度≥98%)、磺胺嘧啶(純度≥99%)、諾氟沙星(純度≥98%)、四環(huán)素(純度≥98%)、磺胺甲基嘧啶(純度≥98%)、硫酸慶大霉素(純度≥99%)、硫酸新霉素(純度≥98%)均購(gòu)于生工生物工程有限公司；恩諾沙星(純度≥98.5%)購(gòu)于浙江國(guó)邦藥業(yè)有限公司，氟苯尼考(純度≥98%)購(gòu)于上海笛柏化學(xué)品技術(shù)有限公司。

1.3 原代菌株MIC、MPC測(cè)定

從劃線保存的單個(gè)平板上挑取AH10單菌落于MH培養(yǎng)基中，培養(yǎng)16 h，參考陳儉清等[6]方法計(jì)數(shù)，將懸浮菌液濃度調(diào)整至106CFU/mL，抗生素濃度配制為1 280 μg/mL。將1.8 mL菌液與0.2 mL抗生素溶液充分混勻，參考戴自英等[7]2倍稀釋法。30 ℃搖床培養(yǎng)24 h，以能抑制細(xì)菌生長(zhǎng)的最小抗生素濃度為該抗生素對(duì)AH10的MIC。單菌落AH10接種于MH培養(yǎng)基過(guò)夜培養(yǎng)，計(jì)數(shù)后，4 000 r/min離心8 min，將菌液調(diào)整為3×1010CFU/mL,采用瓊脂平板法[8]，分別配制濃度為1 MIC～16 MIC抗生素平板，將調(diào)整好的菌液吸取100 μL涂布于平板上，72 h平板上沒(méi)有長(zhǎng)出菌落的最低濃度抗生素即為該抗生素對(duì)AH10的MPC。

1.4 耐藥菌株獲得及耐藥獲得速率評(píng)價(jià)

1.4.1 耐藥性獲得

將五種抗生素MPC平板上菌落數(shù)不大于5的平板上所長(zhǎng)出的單菌落挑取后接種于MH培養(yǎng)基，過(guò)夜培養(yǎng)，取菌液劃線，再次挑取單菌落接種于MH培養(yǎng)基，過(guò)夜培養(yǎng)，參考徐麗娟[9]的方法，采用16S rDNA通用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。測(cè)序后，將所得序列與AH10菌株16S序列上傳至美國(guó)國(guó)立信息技術(shù)生物中心(NCBI，登錄號(hào)：KP999952)比對(duì)，相同者作為原代耐藥株。

將得到的原代耐藥菌株單菌落接種過(guò)夜培養(yǎng)，將所得菌液稀釋至1×107CFU/mL[10]，吸取100 μL到抗生素濃度分別為1 MIC～10 MIC的MH培養(yǎng)基中，過(guò)夜培養(yǎng)。第2天取最大抗生素濃度MH培養(yǎng)基中的菌液，劃線，挑取單菌落，再次接種于MH培養(yǎng)基過(guò)夜培養(yǎng)后，將所得菌液稀釋至1×107CFU/mL，吸取100 μL到抗生素濃度更高的MH培養(yǎng)基中過(guò)夜培養(yǎng)。如此反復(fù)操作，每次設(shè)置10個(gè)梯度，梯度間隔為1MIC，直到原代耐藥株能在含有100 MIC抗生素濃度的MH培養(yǎng)基中生長(zhǎng)。每傳三代鑒定一次，所得序列與AH10菌株16S序列不同者舍去，細(xì)菌過(guò)夜培養(yǎng)12 h為1代。將抗生素誘導(dǎo)后的MIC=4倍誘導(dǎo)前MIC定為該菌株對(duì)該種抗生素耐藥[10]。 按照此方法，共獲得耐藥菌株25株。將耐四環(huán)素的五株耐藥菌株定名為：A1、A2、A3、A4、A5；將耐諾氟沙星的五株耐藥菌株定名為：B1、B2、B3、B4、B5；將耐氟苯尼考的五株耐藥菌株定名為：C1、C2、C3、C4、C5；將耐磺胺嘧啶的株耐藥菌株定名為：D1、D2、D3、D4、D5；將耐硫酸新霉素的五株耐藥菌株定名為：E1、E2、E3、E4、E5。

1.4.2 耐藥獲得速率

將每次傳代測(cè)得的MIC值與最初的MIC值進(jìn)行比較，繪制耐藥獲得速率圖，對(duì)其耐藥速率進(jìn)行評(píng)價(jià)。

1.5 耐藥菌株對(duì)常見(jiàn)抗生素的交叉耐藥

1.5.1 交叉耐藥

將最終耐氟苯尼考、四環(huán)素、諾氟沙星、硫酸新霉素、磺胺嘧啶的菌株分別挑取單菌落接種于MH培養(yǎng)基中，30 ℃培養(yǎng)24 h，按照本文1.3的方法對(duì)沙拉沙星、硫酸新霉素、氟苯尼考、磺胺嘧啶、諾氟沙星、強(qiáng)力霉素、氧氟沙星、恩諾沙星、四環(huán)素、甲風(fēng)霉素、硫酸慶大霉素進(jìn)行MIC的測(cè)定，繪制耐藥圖譜。

1.5.2 交叉耐藥比率

每株耐藥菌株均是由抗生素誘導(dǎo)，除去誘導(dǎo)該菌株產(chǎn)生耐藥性的抗生素，交叉耐藥程度的判斷公式為：

菌株的交叉耐藥比率=(M-1/F-1)×100%。

M表示該菌株所耐抗生素?cái)?shù)。F表示該菌株所測(cè)試抗生素總數(shù)。分析比較耐藥百分比，繪制耐藥百分比圖譜，百分比越高，交叉耐藥越顯著[11]。

1.5.3 耐藥菌株對(duì)各種抗生素耐藥比率

氟苯尼考、四環(huán)素、諾氟沙星、硫酸新霉素、磺胺嘧啶為誘導(dǎo)AH10耐藥的抗生素，除去本身誘導(dǎo)的5株耐藥菌株，耐藥比率判斷公式為：

耐藥比率=(耐該種抗生素的耐藥菌株總數(shù)-5/該種抗生素測(cè)試的耐藥菌株總數(shù)-5)×100%。

未誘導(dǎo)菌株產(chǎn)生耐藥性的抗生素，耐藥比率判斷公式為：

耐藥比率=(耐該種抗生素的耐藥菌株總數(shù)/該種抗生素測(cè)試的耐藥菌株總數(shù))×100%。

1.6 耐藥菌株保存條件

將終耐藥菌株分別均勻涂布于平板上，分別于4 ℃下保存5 、10 、15 、20 、25、30 d，挑取單菌落，擴(kuò)大培養(yǎng)后按照本文1.3的方法，進(jìn)行MIC測(cè)定，探討其耐藥穩(wěn)定性。

2 結(jié)果與分析

2.1 原代菌株AH10體外測(cè)試結(jié)果

經(jīng)測(cè)試諾氟沙星、恩諾沙星、氧氟沙星、沙拉沙星、四環(huán)素、強(qiáng)力霉素、硫酸新霉素、氟苯尼考、甲風(fēng)霉素、硫酸慶大霉素、磺胺嘧啶對(duì)AH10的MIC分別為：0.25、0.25、0.25、0.25、1.0、0.25、8.0、0.5、1.0、0.5、8.0 μg/mL，諾氟沙星、磺胺嘧啶、氟苯尼考、四環(huán)素、硫酸新霉素對(duì)AH10的MPC分別為：2.0、128、3.0、4.0、88 μg/mL。根據(jù)原始嗜水氣單胞菌AH10的體外藥效參數(shù)，確定耐藥菌株篩選時(shí)MH培養(yǎng)基中抗生素添加量。

2.2 供試菌株隨傳代次數(shù)對(duì)五種篩選抗生素的平均耐藥性及獲得速率

供試菌株在供試藥物連續(xù)傳代培養(yǎng)100次中，在各種抗生素篩選壓力下，耐藥菌株隨傳代次數(shù)增加其耐藥性逐步增加，但在抗生素壓力下，傳代在10～25次之間，耐藥菌株耐藥性并無(wú)明顯增加，甚至略有下降，且耐藥性極不穩(wěn)定。傳代至35次穩(wěn)定耐藥后，其耐藥性逐步增加，但傳代至55～65次時(shí)，耐藥性增長(zhǎng)速率減慢，耐藥性基本保持不變，隨后耐藥性大幅度增加(圖1)。耐藥性增加速率呈現(xiàn)不規(guī)則變化，在傳代至10～25次之間，出現(xiàn)了負(fù)增長(zhǎng)，在傳代至65～95次之間MIC增長(zhǎng)倍數(shù)一直處于12倍左右，與耐藥性增長(zhǎng)趨勢(shì)相吻合(圖1)。

2.3 耐藥菌株交叉耐藥

A1、A2、A3、A4、A5耐藥性提高均在100 μg/mL(100倍MIC)以上(表1)，對(duì)同為四環(huán)素類的強(qiáng)力霉素耐藥性提高較大，耐藥性提高最小的達(dá)到15.75 μg/mL(100倍MIC)；對(duì)磺胺嘧啶、氟苯尼考耐藥性提高非常大，其中對(duì)氟苯尼考的耐藥性提高達(dá)到60 μg/mL以上，對(duì)磺胺嘧啶的耐藥性更是達(dá)到了100 μg/mL以上；對(duì)硫酸新霉素耐藥性未提高。B1、B2、B3、B4、B5耐藥性提高在50 μg/mL(200倍MIC，表2)以上，沙拉沙星與氧氟沙星同為喹諾酮類，但對(duì)氧氟沙星耐藥性提高達(dá)到3.75 μg/mL(15倍MIC)，對(duì)沙拉沙星耐藥性未明顯提高；對(duì)酰胺類和四環(huán)素類耐藥性提高較大，對(duì)氟苯尼考耐藥性提高更是達(dá)到50 μg/mL(100倍MIC)以上；對(duì)磺胺類耐藥性同樣提高幅度較大，提高都在20 μg/mL(表2)以上。C1、C2、C3、C4、C5耐藥性均由最初的0.5 μg/mL提高到128 μg/mL以上[大于200倍MIC(表3)]，對(duì)同為酰胺類的甲風(fēng)霉素的耐藥性提高在50 μg/mL(50倍MIC)以上，對(duì)四環(huán)素類提高同樣較為明顯，對(duì)喹諾酮類和氨基糖苷類耐藥性提高較小。D1、D2、D3、D4、D5對(duì)磺胺嘧啶耐藥性提高均在100 μg/mL以上。D1、D2、D3、D4、D5對(duì)四環(huán)素類和酰胺類抗生素耐藥性提高較明顯，未發(fā)現(xiàn)對(duì)氨基糖苷類產(chǎn)生明顯耐藥，對(duì)硫酸新霉素的耐藥性出現(xiàn)下降(表4)。對(duì)比表1、表3、表4我們發(fā)現(xiàn)耐藥株對(duì)磺胺類、酰胺類和四環(huán)素類抗生素耐藥相關(guān)性較為一致(即對(duì)這三類中的一類抗生素產(chǎn)生耐藥對(duì)另外兩類抗生素耐藥性同樣較為明顯)。E1、E2、E3、E4、E5耐藥性提高在120 μg/mL[15倍MIC(表5)]，對(duì)氟苯尼考表現(xiàn)出耐藥性，對(duì)其他各大類抗生素耐藥性與AH10對(duì)比無(wú)明顯變化。

圖1 耐藥菌株隨傳代次數(shù)的平均耐藥性和平均增加速率

表1 耐四環(huán)素菌株對(duì)常見(jiàn)抗生素的交叉耐藥

2.4 耐藥菌株交叉耐藥比率

由圖2可以看出，菌株耐藥后交叉耐藥現(xiàn)象明顯，耐喹諾酮類菌株對(duì)另外四大類抗生素耐藥性提高最明顯，平均交叉耐藥比率為74.0%。耐四環(huán)素類菌株交叉耐藥性同樣較為明顯，平均交叉耐藥性為66.68%，而氨基糖苷類耐藥菌株則相對(duì)交叉耐藥率較低，平均耐藥率不足20%。耐酰胺類菌株平均交叉耐藥性為56.0%，且耐藥后各耐藥株對(duì)另外四類抗生素交叉耐藥各異。耐磺胺類菌株交叉耐藥性則相對(duì)接近,平均耐藥性為48%。

表2 耐諾氟沙星菌株對(duì)常見(jiàn)抗生素的交叉耐藥

表3 耐氟苯尼考菌株對(duì)常見(jiàn)抗生素的交叉耐藥

表4 耐磺胺嘧啶菌株對(duì)常見(jiàn)抗生素的交叉耐藥

圖2 篩選藥物外耐藥菌株耐藥比率

2.5 耐藥菌株對(duì)各種抗生素的耐藥比率

耐藥菌株耐藥比率很高，但差異較大(圖3)，對(duì)氟苯尼考耐藥率最高，達(dá)到了85%。然而對(duì)硫酸新霉素未表現(xiàn)出交叉耐藥性。對(duì)磺胺嘧啶、四環(huán)素、甲砜霉素的耐藥率均達(dá)到了75%。

圖3 篩選藥物外耐藥菌對(duì)抗生素耐藥比率

2.6 耐藥菌株4℃條件下保存耐藥穩(wěn)定性

由表6可以看出，耐藥菌株在4 ℃劃線平板保存條件下，耐藥性出現(xiàn)波動(dòng)，耐藥保存一個(gè)月后，C1、C2、E2下降為原來(lái)的1/2。

表6 耐藥菌4 ℃保存下 MIC

續(xù)表6

3 討論

細(xì)菌在對(duì)抗一種抗生素時(shí)，往往同時(shí)有兩種或兩種以上的耐藥方式[12]，這與本研究中同一種抗生素誘導(dǎo)產(chǎn)生的耐藥菌株，其交叉耐藥性有很大差異相吻合。從耐四環(huán)素類菌株與耐酰胺類菌株呈現(xiàn)出高度的相關(guān)性我們可以看出：這兩類抗生素產(chǎn)生的耐藥株可能存在著相似的耐藥途徑。氨基糖苷類耐藥菌株耐藥后，交叉耐藥現(xiàn)象并不顯著，甚至有些耐藥菌株的MIC相比AH10略有下降，說(shuō)明這類耐藥菌可能有其特有的耐藥方式。 嗜水氣單胞菌在長(zhǎng)期低劑量抗生素環(huán)境下，耐藥性隨著傳代次數(shù)不斷增加，但在平板保存條件下，耐藥性隨保存時(shí)間的延長(zhǎng)卻不斷改變，呈現(xiàn)出下降的趨勢(shì)，這表明：耐藥性變化與其所處的環(huán)境有直接的聯(lián)系。

嗜水氣單胞菌耐藥機(jī)制多樣[13]，尤其是抗生素被廣泛應(yīng)用以來(lái)，細(xì)菌耐藥性迅速增加，耐藥機(jī)制也變得越來(lái)越復(fù)雜。張丹鳳等[14]發(fā)現(xiàn)獲得性藥物外排基因Armb對(duì)氨基糖苷類耐藥起到重要作用，與本研究中氨基糖苷類特有的耐藥方式相吻合；周萬(wàn)蓉[15]和方一鳳等[16]發(fā)現(xiàn)磺胺類和喹諾酮類耐藥均可能為質(zhì)粒介導(dǎo)，可被多種抗生素所誘導(dǎo)，這也與本研究中這兩類抗生素誘導(dǎo)的耐藥株交叉耐藥現(xiàn)象嚴(yán)重相一致。莫嵐等[17]對(duì)酰胺類抗性基因PBPs系統(tǒng)做了較為深入的研究，PBPs系統(tǒng)廣泛存在于細(xì)胞膜表面，通過(guò)細(xì)胞膜表面蛋白的改變來(lái)阻止藥物的侵害，該系統(tǒng)介導(dǎo)耐藥性可廣泛擴(kuò)散。本研究中喹諾酮類、四環(huán)素類和磺胺類耐藥株均對(duì)酰胺類產(chǎn)生了耐藥，說(shuō)明這三類抗生素誘導(dǎo)的耐藥株耐藥性變化與細(xì)胞膜PBPs系統(tǒng)不無(wú)關(guān)系。蔣紅霞等[18]報(bào)道：耐藥機(jī)制與酶的改變、染色體、質(zhì)粒、膜蛋白以及通透屏障等眾多因素有關(guān)，既有遺傳穩(wěn)定性耐藥機(jī)制，又有非遺傳穩(wěn)定性耐藥機(jī)制，研究4 ℃保存條件下耐藥性的變化可能由非遺傳穩(wěn)定性耐藥機(jī)制引起。

為減少耐藥性產(chǎn)生，在防治嗜水氣單胞菌引起的疾病過(guò)程中，應(yīng)首先對(duì)其進(jìn)行最小抑菌濃度(MIC)測(cè)定，在MIC大小相似的情況下，應(yīng)注意輪換使用不同大類的抗生素。本研究發(fā)現(xiàn)，嗜水氣單胞菌耐藥性與抗生素的接觸次數(shù)有關(guān)，接觸次數(shù)越多，則耐藥性增加越明顯?；前奉?、喹諾酮類以及氨基糖苷類易產(chǎn)生交叉耐藥性，且磺胺類和氨基糖苷類抗生素防治效果不佳，此三類抗生素應(yīng)酌情選用。四環(huán)素類和酰胺類抗生素耐藥交叉率較低，且這兩類抗生素不易產(chǎn)生耐藥性，應(yīng)作為首選。因此，在養(yǎng)殖中應(yīng)充分了解各種抗生素對(duì)病原菌的抑制效果，做到定期檢測(cè)[19]，采樣研究，充分掌握第一手資料。建立用藥標(biāo)準(zhǔn)制度，嚴(yán)格按照用藥標(biāo)準(zhǔn)用藥，尤其應(yīng)該建立完整的交叉耐藥標(biāo)準(zhǔn)制度，建立起無(wú)公害的防治體系，保證我國(guó)水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)健康可持續(xù)發(fā)展。

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