全雄黃顙魚紅頭病病原菌的分離鑒定

全雄黃顙魚紅頭病病原菌的分離鑒定

馬士杰，郭錦志，魏嬌，付立霞

（揚州大學(xué)動物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，江蘇 揚州 225009）

黃顙魚（Pelteobagrus fulvidraco）在分類上隸屬鲇形目、鲿科、黃顙魚屬，又名昂刺魚、黃辣丁、黃姑魚，生存水溫為0～38 ℃，最適宜的生長水溫為22～28 ℃，多棲息于緩流多水草的湖周淺水區(qū)和入湖河流處，營底棲生活，尤其喜歡生活在靜水或緩流的淺灘處以及腐殖質(zhì)多和游泥多的地方。雜食性，自然條件下以動物性飼料為主，魚苗階段以浮游動物為食，成魚則以昆蟲及其幼蟲、小魚蝦、螺蚌等為食，也吞食植物碎屑。分布于老撾、越南、中國、朝鮮、俄羅斯西伯利亞東南部，在中國分布于珠江、閩江、湘江、長江、黃河、海河、松花江及黑龍江等水系。其營養(yǎng)豐富，味道鮮美，是我國常見的一種淡水名優(yōu)養(yǎng)殖魚類[1]。普通黃顙魚產(chǎn)量低，個頭小，品質(zhì)參差不齊，難以滿足市場需求，且鲿科魚類雄性要比雌性魚生長速度快很多，倘若增加雄魚的占比，則可以大大增加養(yǎng)殖效益，于是一種通過性逆轉(zhuǎn)與雌核發(fā)育的方法產(chǎn)出的全雄黃顙魚問世了[2]。研究表明，這種全雄黃顙魚無論是養(yǎng)殖產(chǎn)量、出塘規(guī)格還是養(yǎng)殖效益、營養(yǎng)價值，均遠(yuǎn)高于普通的黃顙魚[3]。

在黃顙魚的養(yǎng)殖過程中，常出現(xiàn)一種季節(jié)性的流行性細(xì)菌疾病。病魚腹部膨大，魚體各部位有不同程度的充血，頭頂部位出現(xiàn)紅點狀潰爛，嚴(yán)重時頭頂部開裂并有出血帶，呈現(xiàn)典型的“紅頭”癥狀，常被稱為“紅頭病”。該病高發(fā)于春季和秋季，主要危害黃顙魚種或成魚。紅頭病蔓延速度快，致死率高，防治困難，常給殖戶造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失[4]。

研究發(fā)現(xiàn)，導(dǎo)致不同養(yǎng)殖區(qū)域黃顙魚發(fā)病的致病菌有所不同，分別為遲緩愛德華菌（Edwardsiella tarda）、愛德華菌（Edwardsiella ictaluri）或同屬的愛德華菌亞種[4-5]?，F(xiàn)以患紅頭病的全雄黃顙魚為研究對象，從其病灶處分離純化得到病原菌，通過形態(tài)、生理生化特征、16S rRNA 等方面鑒定，以及藥敏和斑馬魚人工感染試驗，分析其藥敏特性及致病性，以期為全雄黃顙魚“紅頭病”的防治提供參考。

1 材料與方法

1.1 樣品、菌種來源

全雄黃顙魚購自高郵董氏特種水產(chǎn)養(yǎng)殖公司，體長為（14±1）cm，體質(zhì)量為（54±5）g；斑馬魚購自廣東省惠州市惠城區(qū)球記養(yǎng)殖場，體長為（3.5±0.5）cm，體質(zhì)量為（0.6±0.1）g。從患病全雄黃顙魚病灶處分離純化得到受德華菌株YCH；殺魚愛德華菌SHK 和SHL、遲緩愛德華菌ET-1 和ET-13 來自實驗室保存。

1.2 試劑和儀器

LB 肉湯（LB）、腦心浸出液肉湯（BHI）、胰蛋白胨大豆肉湯（TSB）、SS 瓊脂（SS）由北京陸橋技術(shù)股份有限公司提供；革蘭染色液、細(xì)菌微量生化反應(yīng)管及藥敏紙片由杭州濱和微生物試劑有限公司提供；基因組提取試劑盒TIANamp Bacteria DNA Kit、膠回收試劑盒TIANgel Mini Purification Kit 由天根生化科技（北京）有限公司提供；Premix Taq（plus dye）、DNA A-Tailing Kit、pMD 19-T Vector Cloning Kit、Prime STAR HS (Premix)、DL 2000 DNA Marker 和DL 5000 DNA Marker 由寶日醫(yī)生物技術(shù)（北京）有限公司提供；所有引物（表1）由生工生物工程（上海）股份有限公司合成；麻醉劑MS-222由美國默克公司提供。主要儀器設(shè)備有無菌操作臺（蘇州凈化設(shè)備有限公司）、電泳儀（北京六一生物科技有限公司）、PCR 儀伯樂生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品（上海）有限公司。

表1 引物及其序列①

1.3 菌種的分離及純化

從實驗室選取病癥較為典型的瀕死黃顙魚，用75%乙醇對其體表消毒，無菌剖檢。用接種環(huán)取其頭部潰爛處及肝臟、腎臟組織，于BHI 平板上劃線，放入28 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h。選取平板上大小、形狀、色澤一致的優(yōu)勢單個菌落，接種到5 mL的BHI 液體培養(yǎng)基中，放入28 ℃搖床于170 r/min過夜振蕩培養(yǎng)活化。次日待試管內(nèi)液體培養(yǎng)基渾濁，用接種環(huán)蘸取適量菌液，再次于BHI 平板上劃線，選取大小、形狀、色澤一致的優(yōu)勢單個菌落，進(jìn)行反復(fù)劃線培養(yǎng)，直至獲得純培養(yǎng)。取部分菌液裝入離心管，于8 000 r/min 離心15 min，加入無菌磷酸鹽緩沖液（PBS）清洗、吹打，使菌液與PBS 充分接觸，將清洗后的菌液以1∶1 的比例與30%的BHI 甘油混合，充分渦旋封口，于-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/span>

1.4 YCH 菌體特征及生理生化

1.5 16S rRNA 序列分析

采用TIANGEN 小提基因組試劑盒，提取YCH的基因組，提取步驟參照說明書。將提取好的基因組作為模板，利用引物27 F/1492 R 進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。反應(yīng)體系50 μL，正反向引物各1 μL，模板2 μL，Premix Taq 酶25 μL，ddH2O 21 μL。PCR 反應(yīng)程序如下：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性30 s、58 ℃退火30 s，72 ℃延伸2 min，循環(huán)30 次；72 ℃再延伸5 min；于4 ℃保存。

待PCR 反應(yīng)結(jié)束后于1%瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳，再于紫外燈分析儀下對凝膠進(jìn)行切膠回收所需目的片段，連接pMD19-T Vector 載體，并轉(zhuǎn)化入大腸桿菌，挑選陽性菌落，提取質(zhì)粒送生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行序列測定。將測序得到的序列與NCBI 數(shù)據(jù)庫中細(xì)菌基因序列進(jìn)行分析比對，篩選相關(guān)性最高的細(xì)菌序列，通過MEGA11 中的Align組件進(jìn)行序列排列后，采用鄰接法（Neighbor-Join Method）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，并通過自舉法（Bootstrap）進(jìn)行可信度檢驗，自舉時重復(fù)次數(shù)設(shè)置為1 000。

1.6 藥物敏感試驗

采用Kirby-Bauer 紙片擴(kuò)散法，對分離的優(yōu)勢菌株YCH 進(jìn)行藥敏試驗，并參照說明書對數(shù)據(jù)分析。在超凈工作臺，將優(yōu)勢菌株YCH 接種至BHI液體培養(yǎng)基中，28 ℃振蕩培養(yǎng)24 h 后，用無菌PBS洗滌并稀釋調(diào)整至5×107～5×108CFU/mL；取100 μL菌懸液，用滅菌的涂布棒均勻地將菌液涂布于BHI平板上，用滅菌的鑷子將藥敏紙片貼附于培養(yǎng)基上，倒置于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，測量藥敏紙片的抑菌圈直徑（mm）。根據(jù)杭州濱和微生物試劑有限公司提供的藥敏判定標(biāo)準(zhǔn)，進(jìn)行數(shù)據(jù)分析與結(jié)果判定。

1.7 人工感染試驗

攻毒菌株YCH 接種于BHI 液體培養(yǎng)基，28 ℃、180 r/min 振蕩培養(yǎng)至對數(shù)生長期后（OD600約為0.6），離心收集菌體，用pH 值為7.2～7.4 PBS 洗滌3 次，10 倍梯度稀釋成5 種不同濃度（2.3×109，2.3×108，2.3×107，2.3×106和2.3×105CFU/mL）菌懸液備用，同時進(jìn)行平板計數(shù)，以獲得更為精確的菌液濃度。

試驗共設(shè)置6 組，分別為1 個空白對照組和5 個試驗組，將健康的斑馬魚暫養(yǎng)7 d 后，每組20 尾，于規(guī)格相同的水族箱中。試驗組分別注射上述5 種不同濃度的菌株YCH，對照組則注射無菌PBS。注射前，用質(zhì)量濃度50 mg/L 的MS-222 麻醉劑將待注射魚麻醉，防止注射時魚體掙扎，導(dǎo)致機(jī)械損傷。攻毒方式為腹腔注射，注射劑量為20 μL。試驗期間，對人工感染后的斑馬魚正常喂食，對養(yǎng)殖水體連續(xù)充氣、換水，連續(xù)觀察7 d，記錄每日發(fā)病和死亡數(shù)量，并對感染發(fā)病斑馬魚再次進(jìn)行細(xì)菌的分離鑒定（新分離出的菌株命名為YCH-2），最后根據(jù)Reed-Muench 公式[10]計算菌株YCH 對斑馬魚的半數(shù)致死量（LD50）。

1.8 特異性引物檢測

使用特異性引物ESC-F、ESC-R，對YCH、YCH-2及愛德華其他菌屬進(jìn)行PCR 擴(kuò)增鑒定[8]。PCR的反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性5 min，95 ℃變性30 s，58 ℃退火30 s，78 ℃延伸5 min，循環(huán)30 次；72 ℃再延伸5 min；于4 ℃保存。

2 結(jié)果與分析

2.1 分離菌株的形態(tài)特征

從患病黃顙魚體內(nèi)分離獲得1 株優(yōu)勢菌株，在BHI 培養(yǎng)基平板劃線涂板于28 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)，24 h 后可見生長緩慢的菌落，48 h 后可見菌落逐漸明顯，呈圓形、透明或半透明，邊緣整齊，灰白色或者無色的細(xì)小微凸起菌落，見圖1（a）；經(jīng)革蘭染色、1 000 倍油鏡觀察顯示，分離菌株YCH 為革蘭陰性菌，呈紅色短桿狀，見圖1（b）。

圖1 菌株YCH 的形態(tài)特征

2.2 16S rRNA 基因序列

以YCH 菌株基因組作為模板，經(jīng)擴(kuò)增得到的16S rRNA 片段大小約為1 466 bp（圖2）。測序結(jié)果顯示，YCH 菌株16S rRNA 擴(kuò)增產(chǎn)物與Gen Bank 中愛德華菌的相似度高達(dá)99%，YCH 菌株16S rRNA 基因序列分子系統(tǒng)發(fā)育樹顯示，菌株YCH與愛德華菌為一支（圖3）。

圖2 16S rRNA 基因的PCR 產(chǎn)物

2.3 生理生化鑒定

通過系列微量生化反應(yīng)管，對分離菌株YCH進(jìn)行鑒定。結(jié)果顯示，分離菌株YCH 與賴氨酸、葡萄糖、麥芽糖等試劑反應(yīng)呈陽性，與精氨酸、枸櫞酸鹽、甘露醇、水楊素、硫化氫、七葉靈等試劑反應(yīng)呈陰性（表2），與參照菌株愛德華菌JXHS 數(shù)據(jù)一致，與遲緩愛德華菌ATCC15947 的數(shù)據(jù)較為相似；菌株YCH 和參照菌株JXHS 的硫化氫為陰性，而遲緩愛德華菌ATCC15947 的硫化氫為陽性。

表2 菌株YCH 的生理生化特性①

2.4 藥敏

菌株YCH 對35 種藥物的敏感性見表3。由表3可見，菌株YCH 對紅霉素、四環(huán)素、諾氟沙星、環(huán)丙沙星、氨曲南、頭孢西丁、氧氟沙星和妥布霉素等8種藥物耐藥，對青霉素、克林霉素及卡那霉素中度敏感，而對其他24 種測試藥物，包括苯唑西林、大觀霉素、萬古霉素、氯霉素、左氟沙星、多黏菌素B、頭孢他啶、鏈霉素、呋喃妥因和頭孢唑啉、頭孢呋辛等則均為敏感。

表3 菌株YCH 對35 種藥物的敏感性①

續(xù)表

2.5 人工感染后癥狀

人工感染健康的斑馬魚后，高濃度組注射1 d后就開始出現(xiàn)死亡，對照組未見異常。2～4 d 為各組發(fā)病死亡高峰期，被感染的斑馬魚出現(xiàn)與自然發(fā)病黃顙魚相似的癥狀，魚腹部鼓起并伴有腹水、體表充血、皮膚潰爛、眼球外突，雖未見頭部裂開，但頭部出現(xiàn)明顯的腫脹突起（圖4）。試驗結(jié)束時，對照組斑馬魚沒有出現(xiàn)死亡，試驗組中菌株濃度為2.3×109和2.3×108CFU/mL 組死亡率最高，均為100%；其次是2.3×107CFU/mL 組，死亡率為68.4%；2.3×106和2.3×105CFU/mL 組死亡率較低，分別為7.4%和0。根據(jù)Reed-Muench 方法計算，菌株YCH 對斑馬魚的LD50為2.3×105CFU。從死亡病魚體內(nèi)能再次分離到細(xì)菌，且形態(tài)特征及理化特性等方面均與所述菌株YCH 完全一致。分離菌株YCH 對斑馬魚的人工感染試驗結(jié)果見表4。

圖4 健康斑馬魚和被感染后的病魚對比

表4 分離菌株YCH 對斑馬魚的人工感染試驗結(jié)果

2.6 特異性引物

特異性引物檢測結(jié)果顯示，從患紅頭病的全雄黃顙魚體內(nèi)分離的菌株YCH 及再次人工感染斑馬魚后分離所得菌株YCH-2，均可用ESC-F、ESC-R擴(kuò)增出129 bp 的預(yù)期目的條帶，而同組的其他菌株均未擴(kuò)增出條帶（圖5）。

圖5 種特異性引物對愛德華菌分離菌株的鑒別

3 討論

黃顙魚在規(guī)?；斯ゐB(yǎng)殖中易感染各種疾病，導(dǎo)致頭部發(fā)紅的主要致病菌為愛德華菌。愛德華菌屬分為愛德華菌、?？茞鄣氯A菌（Edwardsiella hoshinae）和遲緩愛德華菌，其中遲緩愛德華菌的分布和宿主范圍比保科愛德華菌和愛德華菌更加廣泛[13]。愛德華菌是導(dǎo)致鲇形目魚類發(fā)病的一種常見致病菌，于1979 年在美國的斑點叉尾（Ictalurus punctatus）體內(nèi)首次分離獲得[14]。流行病學(xué)與病理特征分析發(fā)現(xiàn)，愛德華菌和遲緩愛德華菌導(dǎo)致的疾病分為急性型與慢性型，其中急性型發(fā)病速度快，會導(dǎo)致魚體內(nèi)臟功能衰退，若救治不及時，一周內(nèi)就會導(dǎo)致大量死亡；慢性型則通常呈階段性，初期發(fā)病魚表征不明顯，先出現(xiàn)體表不同程度的病變，隨之?dāng)z食量減少；隨病程發(fā)展，出現(xiàn)停食、頭頂部充血、發(fā)紅、潰爛等現(xiàn)象，并伴隨體表潰爛、泄殖孔紅腫充血，頭部由最初的潰爛直至露出頭骨及腦組織。

斑馬魚作為一種新型的脊椎模式生物，具有繁殖能力強(qiáng)、個體小、易養(yǎng)殖等諸多優(yōu)點[15]。在毒性試驗中有著非常有利的生物學(xué)特性，使其成為感染研究中重要的模型生物之一。劉春等[16]以斑馬魚為試驗動物，研究與愛德華菌同屬的遲緩愛德華菌的致病力并得到證實。Hawke 等[17]于2011 年在美國不同州實驗室的斑馬魚體內(nèi)，分離得到了愛德華菌。本試驗認(rèn)為，愛德華菌感染鲇形目魚類比較多，從斑馬魚身上分離得到愛德華菌，且癥狀與黃顙魚人工感染癥狀相似，感染的斑馬魚在1～2 周內(nèi)快速死亡。在國內(nèi)斑馬魚養(yǎng)殖場中，也在病魚體內(nèi)分離到了愛德華菌，回歸感染致死率可達(dá)80%[18]。說明斑馬魚可作為愛德華菌毒性試驗的模式動物，代替黃顙魚做人工感染試驗。

本研究從患有“紅頭病”的全雄黃顙魚中，分離純化獲得優(yōu)勢菌體YCH。該菌株的形態(tài)特征、生理生化指標(biāo)以及16S rRNA 的基因序列分析比對結(jié)果顯示，菌體YCH 為愛德華菌。藥敏試驗結(jié)果顯示，苯唑西林、大觀霉素、左氟沙星、多黏菌素B、頭孢他啶、鏈霉素和頭孢呋辛等成分的藥物對該病菌的生長有抑制作用，這對日后愛德華菌的防治及研究有著積極的推進(jìn)作用。

本試驗的藥敏數(shù)據(jù)在實際生產(chǎn)中僅作參考，在水產(chǎn)養(yǎng)殖中，應(yīng)選擇合適的國標(biāo)魚藥，同時，需注意用藥量，避免產(chǎn)生耐藥性。由于“紅頭病”的病灶通常位于魚腦部，很多藥物無法很好地直擊病灶處，且愛德華菌在環(huán)境溫度適宜的情況下暴發(fā)迅速，養(yǎng)殖戶常常來不及反應(yīng)而造成經(jīng)濟(jì)損失。因此，在養(yǎng)殖過程中，要注重飼料配比，適當(dāng)添加維生素等微量元素，以增加魚體抵抗力。同時要注重養(yǎng)殖水質(zhì)，提升養(yǎng)殖水環(huán)境質(zhì)量。疾病防治原則是以預(yù)防為主，防治結(jié)合。