一例氣單胞菌引起池塘草魚死亡案例

一例氣單胞菌引起池塘草魚死亡案例

田海軍1，李世偉1，2

（1.信陽農(nóng)林學院水產(chǎn)學院，河南 信陽 464000；2.廈門利洋水產(chǎn)科技有限公司，福建 廈門 350200）

草魚（Ctenopharyngodon idellus）屬于鯉形目，草魚屬，俗稱鯇魚，因其生長迅速、餌料來源廣泛，并且生長迅速、產(chǎn)量高，成為中國淡水養(yǎng)殖的四大家魚之一。草魚是我國特有魚類，但以其獨特的食性和覓食手段從而被當作拓荒者帶到世界各地[1]。草魚養(yǎng)殖過程中容易患上爛鰓、腸炎、赤皮、病毒性出血病等多種疾病[2-3]，細菌性病原致病的情況很嚴重。因此，通過對草魚細菌性疾病的病原菌分離與鑒定對草魚病害的防治具有較大意義[4]。

1 材料和方法

1.1 發(fā)病草魚

2017年3月份，廣東珠海一草魚養(yǎng)殖池塘開始出現(xiàn)草魚死亡，池塘面積8×667m2，3臺葉輪式增氧機，水深1.8 m，池內(nèi)有7 500 kg魚，養(yǎng)殖前沒有清塘，從3月中期開始，每天死亡十幾條，觀察發(fā)病草魚，魚體表發(fā)紅，尾鰭發(fā)白，鰓蓋、鰭條充血，剪開肚子有腹水，肝臟發(fā)黑，腸空、發(fā)紅（如圖1）。

1.2 實驗材料

圖1 發(fā)病草魚

LB固體培養(yǎng)基、70%酒精、冰箱、恒溫培養(yǎng)箱、高壓蒸汽滅菌鍋、顯微鏡、培養(yǎng)皿、燒杯、研缽、試管、接種環(huán)、酒精燈等。

1.3 病原菌的分離與純化培養(yǎng)

在無菌條件下，先用70%酒精對魚體表面消毒，然后分別取草魚的肝臟、腎臟、脾臟于無菌研缽中搗碎。分別加少量無菌水后分別劃線接種于LB固體培養(yǎng)基平板上，放入28℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。選取平板上的優(yōu)勢菌落進行純化培養(yǎng)，最終培養(yǎng)至3～5代后獲得形態(tài)一致的純菌落。選取單個菌落經(jīng)過涂片、HE染色、鏡檢，確認為純培養(yǎng)物。選取一個優(yōu)勢菌落，在LB固體培養(yǎng)基斜面上-80℃冰箱保存（通過抑制酶的活性來抑制細胞的生命活動的方式延長細胞存活時間），備用。

1.4 分離菌落觀察

將純培養(yǎng)物接種于LB固體培養(yǎng)基平板上，在28℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，觀察并記錄培養(yǎng)出的細菌菌落特征。將獲得的純培養(yǎng)物進行革蘭染色。在載玻片上加1滴無菌水，用接種環(huán)挑取少許菌落與無菌水混合并進行均勻涂布。經(jīng)自然干燥、火焰固定后，用草酸銨結晶紫染液染色1～2min，加水沖洗，再加革蘭碘液后1～2 min，加水沖洗，再加復紅酒精染液等50～60 s后加水沖洗。等待干燥后鏡檢。菌體被染成紫藍色為陽性，被染成紅色則為陰性。

1.5 病原菌的鑒定

采用API細菌數(shù)值鑒定系統(tǒng)，這同時能測定20項以上生化指標，可用做快速鑒定細菌的長形卡片（21 cm×4.5 cm，法國生產(chǎn)），上面排列著20個塑料管，管內(nèi)加有適量糖類等生化反應的干粉（有標簽標明）以及反應產(chǎn)物的顯色劑。每份產(chǎn)品都有薄膜覆蓋，這樣保證了無雜菌污染。

使用時，首先打開內(nèi)部附有的一瓶無菌基本培養(yǎng)基（液體），用來稀釋待鑒定的純菌落。把配制成的濃度適中的細菌懸液用無菌滴管逐個以0.1 mL的量加入到每個小管中。在經(jīng)過24～28 h保溫后，觀看每個小管是否發(fā)生了顯色反應。將結果記錄在相應表格中，然后按照規(guī)定對結果進行編碼、查檢索表，就可以獲得該菌種的鑒定結果。

1.6 藥敏實驗

藥敏實驗采用的是紙片法（購自杭州某微生物試劑公司），選用在生產(chǎn)上常用的藥物進行實驗研究。

首先進行細菌培養(yǎng)，用無菌生理鹽水洗后吸取0.2 mL菌液在LB固體培養(yǎng)基平板上進行均勻涂布。貼上藥敏紙片，設4個平行實驗組。放置于28℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。觀察有無抑菌圈產(chǎn)生，同時記錄抑菌圈直徑，計算其平均值。然后再重復做1次實驗，最后依據(jù)抑菌圈直徑比值照判斷標準得到藥敏實驗結果。

圖2 病原菌分離分離與純化培養(yǎng)

1.7 臨床用藥

根據(jù)藥敏實驗結果和池塘情況使用藥物治療。

2 結果

2.1 病原菌分離與純化培養(yǎng)結果

在LB固體培養(yǎng)基上形成菌落為其菌落形態(tài)：圓形、圓滑、濕潤邊緣整齊、微凸、半透明、灰白色至淡黃色中等大小的菌落，易挑取（見圖2）。

2.2 分離菌菌鏡檢結果

革蘭染色陰性，短桿菌，懸滴標本觀察動力，運動活潑（見圖3）。

2.3 分離菌生理生化實驗結果

結果見表1。

2.4 藥敏實驗結果

分離菌藥敏實驗結果見表2、圖4。

2.5 臨床治療結果

用藥：第1天，陰雨天，死亡15條左右，上午10：00，“鰓皮腸利康”（1包）拌兩包料。第2天，陰雨天，死亡6條，17：00，“鰓皮腸利康”（1包）拌1包料。第3天，陰天，死亡6、7條，10：00喂“鰓皮腸利康”（1包）拌2包料。之后，草魚死亡量明顯減少，病情基本得到控制。

圖3 分離菌革蘭染色

圖4 藥敏試驗

表1 細菌生理生化試驗結果

3 討論

根據(jù)分離菌的形態(tài)特征、培養(yǎng)特性和生化特性等實驗結果確定該分離病原菌為氣單胞菌[5]。氣單胞菌廣泛分布于自然界中，能從表層和地下來源的飲用水中分離出該菌，氣單胞菌屬已經(jīng)被國際上列為腸道致病菌之一，是危害草魚的主要病原菌之一[6]，感染后可發(fā)生胃腸炎、外傷感染和敗血癥并具有高病死率[7]。實驗從草魚的肝脾腎等組織中分離出了氣單胞菌，為臨床治療提供了理論依據(jù)。但由于時間等多種條件限制，不能做回歸實驗。

由藥敏實驗結果可知病原菌對“鰓皮腸利康”、“鰓膚康”、“出敗康”、“氟多力”高度敏感。臨床上選用高敏藥物“鰓皮腸利康”（主要成分：諾氟沙星）進行的治療，根據(jù)“鰓皮腸利康”特性采用了拌料口服的方式。諾氟沙星（Norfloxacin）化學名為1-乙基-6-氟-1，4-二氫-4-氧代-7-（1-哌嗪基）-3-喹啉羧酸，作用原理：通過作用于細菌DNA螺旋酶的A亞單位，抑制DNA的合成和復制而導致細菌死亡，是氟喹諾酮類抗菌藥，對需氧革蘭陰性桿菌的抗菌活性高。鹽酸小柴堿是小檗堿（Berberine）的鹽酸鹽（俗稱鹽酸黃連素），小檗堿分子式[C20H18NO4]+，是一種異喹啉生物堿，又稱黃連素，存在于小檗科等4科10屬的許多植物中，抗菌譜廣，體外對多種革蘭陽性及陰性菌均具抑菌作用，臨床主要用于腸道感染及菌痢等。

表2 藥敏試驗結果

具體治療：因前期沒有清塘，草魚出現(xiàn)死亡后用了絮凝的凈水產(chǎn)品，使塘底滋生了更多的有害細菌。后來又用了很多殺蟲的藥物，破壞了水體的生態(tài)平衡，加上一直陰雨天氣，池塘自凈能力差，溶氧一直不高，建議首先控制好死亡量，然后改善好池塘環(huán)境，最后再根治魚病。在注意增氧的前提下連續(xù)3 d每天1包“鰓皮腸利康”拌料投喂，草魚食欲恢復，死亡數(shù)量明顯減少。

氣單胞菌致病是由多種致病因子協(xié)同作用的結果，指導臨床用藥時為防止濫用抗生素而引起的病原菌抗藥性問題，對分離的病原菌用藥敏實驗測定后再合理選用藥物治療才能達到最好的效果。該菌以往被認為是低毒力條件性病原菌，但近年該菌引起感染性疾病的報道日益增多，并對多種抗生素產(chǎn)生不同程度的耐藥性，需要加以重視，注意衛(wèi)生等各方面管理。臨床上，早發(fā)現(xiàn)，早治療，防止多種病原交叉感染，提高機體抵抗力，科學養(yǎng)殖。

[1]潘迎捷.水產(chǎn)辭典[M].上海：上海辭書出版社，2007：284-353.

[2]楊秀榮，曾燕玲，魏志琴.網(wǎng)箱養(yǎng)殖患病草魚細菌分離鑒定與回復感染研究 [J].西南師范大學學報（自然科學版），2012，37（6）：83-86.

[3]權可艷，徐麗娟.恩諾沙星控制草魚維氏氣單胞菌的用藥方案[J].淡水漁業(yè)，2013，43（2）：48-53.

[4]隗黎麗，王自蕊，楊竹青.草魚2株氣單胞菌的分離與鑒定[J].水產(chǎn)科學，2013，32（6）：348-352.

[5]楊正時.氣單胞菌屬分類學研究進展[J].中國人獸共患病雜志，1990，6（14）：9.

[6]韓先樸，李偉，徐伯亥.斑點氣單胞菌對草魚的毒力[J].水生生物學報，1987，11（3）：284-286.

[7]樊俊杰.氣單胞菌腹瀉 [J].中華流行病學雜志，1989，10（5）：306-309.2016-11-03）10.3969/j.issn.1004-2091.2017.05.018