魚類諾卡氏菌病的研究進展

魚類諾卡氏菌病的研究進展

朱志東 ，呂莉 ，鄧劍壕 ，馮豆 ，許佳楠 ，蔡延渠 ，辛年香 ，朱盛山

（1.廣東藥科大學中藥開發(fā)研究所，廣東 廣州 510006；2.廣州普精生物科技有限公司，廣東 廣州 510006）

諾卡氏菌?。∟ocardiosis）是由諾卡氏菌引起的一種人獸共患的慢性傳染病。我國1980年首次報道了諾卡菌病例，截至目前已報道至少有13個?。ㄖ陛犑?、自治區(qū)）的人群中存在諾卡氏菌的感染[1]。諾卡氏菌病在水產養(yǎng)殖方面危害極大[2－3]，在亞洲地區(qū)養(yǎng)殖魚類中諾卡氏菌病頻發(fā)，發(fā)病魚種包括鰤[4－5]、鯧[6－8]、大黃魚[9]、招財魚[10]、羅非魚[7]、烏鱧[11]、大口黑鱸[11]、石斑魚[7]、四指馬鲅[7]、紫紅笛鯛[7]、紅笛鯛[7]、六帶鲹[7]等。隨著養(yǎng)殖業(yè)集約化程度的提高，養(yǎng)殖過程中的疾病也日趨嚴重，魚類諾卡氏菌病自然發(fā)病率可達到15%～30%，嚴重的達到60%，人工感染的病死率可高達90%～100%[12]。近年來魚類諾卡氏菌病引起越來越多學者的廣泛關注，抗生素治療細菌感染性疾病難以根治，由于用藥療程長，長期使用抗生素容易產生耐藥性，抗生素殘留也會導致人體蓄積性中毒，而中藥對人毒性低，不易引起細菌耐藥性[13]，在治療魚類諾卡氏菌病具有很大優(yōu)勢，如本課題組蔡延渠[18－19]論述用中草藥抗胃腸道細菌感染和呼吸道細菌感染的療效，發(fā)現(xiàn)中草藥是臨床治療胃腸道細菌和呼吸道細菌感染的另一良好“替代抗生素”；如本課題組周澤琴[2]研究的中藥復方NZ方抑菌性顯著，對副溶血弧菌、嗜水氣單胞菌、創(chuàng)傷弧菌的最低抑菌濃度僅為0.313 mg/mL，如何有效防治諾卡氏菌病對魚類養(yǎng)殖的侵襲也備受水產業(yè)界人士關注和重視。

魚類諾卡氏菌病的致病菌主要是鰤魚諾卡氏菌（N.seriolae）[14－17]、星狀諾卡氏菌（N.Asteroides）[10]，本文就魚類諾卡氏菌病的流行環(huán)境、診斷方法以及防治手段等方面進行綜述，希望為魚類諾卡氏菌病的防治提供參考。

1 流行環(huán)境

魚類諾卡氏菌病以水溫在25～28℃時發(fā)病最為嚴重。該病流行季節(jié)較長，發(fā)病魚常為1齡或2齡魚，發(fā)病高峰主要集中在6—9月份。發(fā)病時魚一般不吃食，環(huán)境變化后，尤其在雨后，發(fā)生死亡現(xiàn)象更加嚴重[12、23]。

2 診斷方法

2.1 主要癥狀

患病初期，反應遲鈍，食欲下降，有時肛門紅腫，體表無明顯癥狀；患病中期，體表有損傷、潰爛，腹部膨脹等現(xiàn)象；患病晚期，背部、腹部和尾部體表損傷并潰爛出血，更有甚者體表形成膿腫或瘺管，隨后逐漸死亡[20－22]。

2.2 解剖

王國良等[11]取浙江蕭山患鰤魚諾卡氏菌病的烏鱧解剖，膨大的腹腔內有少量透明或淡黃色液體，在肝、脾、腎等內臟組織中出現(xiàn)乳白色或淡黃色結節(jié)，直徑0.1～0.5 cm。黃郁蔥等[22]從湛江港、陽江閘坡取海水網箱養(yǎng)殖的患鰤魚諾卡氏菌病的卵形鯧鲹進行解剖，肝、腎臟、脾臟充血并腫大，鰓、肝、腎臟、脾臟、鰾、腸系膜等有大量直徑0.1～0.3 cm的白色結節(jié)。林偉等[10]取信陽市患星狀諾卡氏菌病的招財魚，解剖觀察，有黃色腹水，肝、脾、腎明顯腫大并有直徑0.1～0.5 cm的白色結節(jié)。

魚類諾卡氏菌病又稱結節(jié)病，可在內臟各器官形成肉眼可見直徑0.1～0.5 cm的大量白色結節(jié)，以脾臟和腎臟最為顯著[24]。但除諾卡氏菌感染會引起魚內臟器官出現(xiàn)白色結節(jié)外，殺魚巴斯德氏菌、嗜水氣單胞菌、哈維氏弧菌、惡臭假單胞菌、維羅納氣單胞菌等致病菌亦會導致魚腹腔或內臟器官出現(xiàn)白色結節(jié)的癥狀，所以，發(fā)現(xiàn)患病魚內臟出現(xiàn)白色結節(jié)癥狀，也不能就絕對的認為這是魚類諾卡氏菌病[25－26]。

2.3 生物技術

王國良等[27]針對鰤魚諾卡氏菌16S—23S rRNA基因內轉錄間隔序列，設計了四條LAMP引物，擴增后的產物經電泳后呈現(xiàn)特異性的LAMP梯形條帶，建立LAMP法，對患病烏鱧、大黃魚、黃姑魚組織樣品進行檢測，發(fā)現(xiàn)鰤魚諾卡氏菌DNA的LAMP擴增為陽性。蔣依依等[28]根據鰤魚諾卡菌16S—23S轉錄間隔區(qū)（ITS）序列設計特異性引物，建立了鰤魚諾卡氏菌特異性PCR快速檢測方法，并對鰤魚諾卡氏菌人工感染的大口黑鱸組織進行了檢測，結果從大口黑鱸組織中檢出陽性鰤魚諾卡菌ITS序列擴增片段、陽性率100%，比傳統(tǒng)細菌分離鑒定方法更加靈敏、快速且高效。王國良等[29]根據GenBank中鰤魚諾卡氏菌16S—23S rRNA基因序列設計并合成一對特異性引物，經反應體系優(yōu)化后建立了檢測魚諾卡氏菌的SYBR GreenⅠ實時熒光定量PCR方法，后提取患病大黃魚DNA作SYBR GreenⅠ實時熒光定量PCR檢測，鰤魚諾卡氏菌DNA擴增為陽性，進而檢測出大黃魚鰤魚諾卡氏菌病，為魚類諾卡氏菌病的早期快速檢測與防控提供有效的技術支持[31]。

3 防治

3.1 化學藥

蔣依依等[30]取患病加州鱸體內分離鰤魚諾卡氏菌，采用紙片擴散法測定其對10種抗生素的敏感性，該菌株對四環(huán)素和氯霉素高度敏感，抑菌圈直徑為57 mm、48 mm；對磺胺類和氨芐青霉素最不敏感，抑菌圈直徑都為0 mm。曹錚等[31]從患病烏鱧體內分離的鰤魚諾卡氏菌，通過紙片擴散法研究其對14種常用抗生素的敏感性，發(fā)現(xiàn)該菌株對紅霉素最敏感，抑菌圈直徑分別為46 mm；對阿米卡星、新霉素、青霉素G、先鋒V等耐藥，抑菌圈直徑分別為 14 mm、12 mm、0 mm、0 mm。林偉等[32]對發(fā)病招財魚體內分離得到的星狀諾卡氏菌，用紙片擴散法試驗其對14種抗生素的藥敏性，紅霉素最敏感，抑菌圈直徑達45 mm，其次為環(huán)丙沙星，抑菌圈直徑為32 mm；對阿米卡星、新霉素、青霉素G、先鋒V等耐藥抑菌圈直徑分別為13 mm、16 mm、0 mm、0 mm。

滿其蒙等[33]研究用紅霉素、恩諾沙星、氟苯尼考治療卵形鯧鲹鰤魚諾卡氏菌病的效果，人工腹腔注射感染后，對第1天投藥和第4天投藥的治療情況進行比較，給藥劑量20 mg/（kg·d），拌料投喂，連續(xù)投喂10天。結果顯示，攻毒后第一天投藥、攻毒后第4天投藥及預防組治療效果較好的分別是恩諾沙星、紅霉素及氟苯尼考，其對卵形鯧鲹、鰤魚諾卡氏菌感染的保護率分別為53.4%、30%及26.7%。孟思妤[34]用22.0 mg/kg魚體質量的氨芐青霉素治療，拌料后陰干投喂，每天投喂1次，連續(xù)投喂6 d，發(fā)現(xiàn)烏鱧的死亡數(shù)量只有十幾條；用20.0 mg/kg魚體質量的交沙霉素治療，拌料后陰干投喂，每天投喂1次，連續(xù)投喂5 d后烏鱧死亡數(shù)量明顯下降，但是，用藥后第9天每天烏鱧死亡數(shù)量還有300尾以上。

3.2 生物藥

解俊等[35]應用濃度為108CFU/mL的0.4%甲醛滅活鰤魚諾卡氏菌對烏鱧進行腹腔注射，劑量為0.5 mL/尾，對照組同法等量注射滅菌生理鹽水。分別在實驗第 0、3、6、9、12、15、18、21 d 抽取烏鱧血液，測定其血細胞數(shù)、血清總蛋白含量及血清堿性磷酸酶、酸性磷酸酶、超氧化物歧化酶、溶菌酶活性。與對照組相比，注射滅活鰤魚諾卡氏菌后，烏鱧血細胞數(shù)呈先升高后降低的趨勢，在實驗第12天時注射組血細胞數(shù)顯著高于對照組90.33×1010cell/L；血清總蛋白含量在實驗第9天后均高于對照組且第9天的峰值比第21天大0.96金氏單位/100 mL；血清堿性磷酸酶、酸性磷酸酶、超氧化物歧化酶和溶菌酶等活性在實驗時間內均有所增強。研究表明，滅活菌苗的刺激能引起烏醴血細胞的增殖以及血清中各非特異性免疫指標的變化，從而提高機體自身的免疫保護力。

3.3 中草藥

目前，研究中藥治療諾卡氏菌病的較少。舒孝順等[36]使用K－B紙片法測定菝葜水提物對諾卡氏菌等細菌的敏感性，發(fā)現(xiàn)菝葜水提物2 mg/片對諾卡氏菌敏感，抑菌圈直徑為10.3 mm；進一步使用二倍稀釋平皿法測定其對諾卡氏菌的MIC值，結果為2.08 g/mL。

4 討論與總結

諾卡氏菌病潛伏期長，發(fā)病前期無癥狀或癥狀不明顯，后期治愈率低，發(fā)病率高，發(fā)病病死率高，對魚類危害大，給水產養(yǎng)殖產業(yè)帶來嚴重危害。臨床上，可根據魚類諾卡氏菌病的流行特征及觀察體表、鰓絲、腹腔和內臟的發(fā)病癥狀基本診斷該病。進一步判斷要通過做細菌分離鑒定，確診后再做藥敏試驗，這樣才能對癥用藥，達到良好治療效果[25]。水產動物致病性諾卡氏菌的生物檢測技術已日益成熟，主要有PCR法和環(huán)介導恒溫擴增技術法，通過DNA片段擴增為陽性，進而診斷魚類諾卡氏菌病，為魚類諾卡氏菌病的早期快速檢測與防控提供有效的技術支持[29、37、39]。

目前對于魚類諾卡氏菌病的防治仍以化學藥物為主，如四環(huán)素、紅霉素、環(huán)丙沙星、氟苯尼考等，但存在對水體環(huán)境和危害人體健康等問題，中華人民共和國農業(yè)部已將其列為水產養(yǎng)殖禁藥，且當疾病發(fā)生后，一些敏感性抗生素也很難達到治療效果，同時也存在阿米卡星、新霉素、青霉素G、先鋒V等抗生素耐藥的問題[31－32]。在生物藥方面，水產動物諾卡氏菌病也進行了疫苗方面的研究，無論是滅活疫苗還是弱毒疫苗效果都很有限，還沒有商品化疫苗可以使用[25、38]。迄今為止，尚未見到關于水產動物諾卡氏菌病中草藥有效防治方面的報道，關于其抗菌的篩選方面的研究也很少[38、40]。

近年來，隨著漁業(yè)養(yǎng)殖疾病的暴發(fā)越來越頻繁，我國魚類養(yǎng)殖業(yè)受病害肆虐情況嚴重，患魚類諾卡氏菌病魚的肝臟、腎臟等內臟器官損傷較大，治愈難度相當大，因此，對于該病的控制還是要“預防為主、防重于治”。此外，由于高效安全的漁藥很匱乏，諾卡氏菌的致病機制仍然不清楚，導致難以徹底治愈諾卡氏菌病。筆者在研究中草藥防治魚類諾卡氏菌病中發(fā)現(xiàn)復方MY具有很好的效果，選取烏鱧（30～40 g）480條，鰤魚諾卡氏菌（攻毒感染），后分成四組高劑量組、中劑量組、低劑量組、空白組養(yǎng)在10 m3的魚缸中，6 d后當烏鱧體表潰爛出血，肛門紅腫，解剖發(fā)現(xiàn)內臟（腎、脾、肝）白色結節(jié)增多等比較嚴重的癥狀后拌料進行給藥。內臟白色結節(jié)鏡檢可見大量短桿狀細菌，進一步分離鑒定為鰤魚諾卡氏菌，結果：空白組全部死亡；復方MY高劑量組存活率100%；復方MY中劑量組存活率91%；復方MY低劑量組存活率42%，由此可見中藥在防治魚類諾卡氏菌病是具有一定的效果。相關研究顯示，水產養(yǎng)殖用中草藥不會有抗生素殘留問題。筆者期望后續(xù)的研究者應加強中草藥防治魚類諾卡氏菌病的研究，尤其是新藥的研發(fā)、中草藥資源的開發(fā)，這將促進水產綠色養(yǎng)殖的發(fā)展。

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