蝦類肝腸胞蟲流行病學(xué)研究進(jìn)展

蝦類肝腸胞蟲流行病學(xué)研究進(jìn)展

胡吉卉，李正民，段健誠(chéng)，高煥

（1. 江蘇海洋大學(xué)海洋科學(xué)與水產(chǎn)學(xué)院，江蘇省海洋生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；江蘇 連云港 222005；2. 江蘇省農(nóng)業(yè)種質(zhì)資源保護(hù)與利用平臺(tái)，江蘇 南京 210014）

蝦肝腸胞蟲（Enterocytozoon hepatopenaei, EHP）隸屬于微孢子蟲科（Microsporidia）、腸胞蟲屬（Enterocytozoon），成熟的孢子大小為（0.9±0.3）μm×（1.8±0.3）μm，呈橢圓形[1－2]。2003 年在泰國(guó)養(yǎng)殖的斑節(jié)對(duì)蝦（Penaeus monodon）中發(fā)現(xiàn)，2009 年被成功分離，并被定義為孢子蟲屬的一個(gè)新物種[3]。

肝腸胞蟲作為一種專性細(xì)胞內(nèi)寄生蟲，主要寄生在蝦類肝胰腺肝小管上皮細(xì)胞內(nèi)，且具有高度傳染性。凡納濱對(duì)蝦（P. vannamei）、脊尾白蝦（Palaemon carincauda）和斑節(jié)對(duì)蝦（P. monodon）等主要經(jīng)濟(jì)養(yǎng)殖蝦類都是其主要感染對(duì)象，感染后會(huì)造成蝦類生長(zhǎng)緩慢或停滯，是影響全球蝦類養(yǎng)殖生產(chǎn)的重要病原之一[4－5]。該文總結(jié)了國(guó)內(nèi)外現(xiàn)有的研究成果，重點(diǎn)介紹了肝腸胞蟲在流行情況、病理癥狀、致病機(jī)理、傳播途徑、檢測(cè)方法和防治措施等方面的研究進(jìn)展，以期為肝腸胞蟲的病害防治提供指導(dǎo)幫助。

1 流行情況

自2003 年被發(fā)現(xiàn)以來(lái)，中國(guó)、印度、委內(nèi)瑞拉、馬來(lái)西亞、印度尼西亞等多個(gè)國(guó)家都有EHP 檢出的相關(guān)報(bào)道[6]。從2013 年開始，我國(guó)多個(gè)省市的蝦類養(yǎng)殖基地先后發(fā)現(xiàn)了EHP 感染，并且感染率呈上漲趨勢(shì)。2015 年上半年，浙江省水產(chǎn)技術(shù)推廣站檢測(cè)了70 多個(gè)苗種場(chǎng)的134 份南美白對(duì)蝦蝦苗樣品，結(jié)果發(fā)現(xiàn)EHP 的檢出率達(dá)53.8%[7]；同年5—9 月，舟山地區(qū)270 份凡納濱對(duì)蝦樣本中，EHP 的檢出率高達(dá)85.19%[8]。2015—2017 年天津市蝦肝腸胞蟲的流行情況調(diào)查顯示，當(dāng)?shù)仞B(yǎng)殖蝦類中存在不同程度的EHP 感染，2015 年和2016 年EHP 的檢出率分別為56.96%、69.52%[9]。2019 年江蘇省溫室池塘養(yǎng)殖蝦類中EHP 的患病率為56.3%，而土塘養(yǎng)殖蝦類中EHP 的患病率則達(dá)到了79.5%[10]。由此可見，EHP 引發(fā)的感染病已經(jīng)嚴(yán)重危害了我國(guó)蝦類養(yǎng)殖業(yè)。

2 病理癥狀

EHP 會(huì)使養(yǎng)殖蝦類感染肝胰腺微孢子蟲?。℉epatopancreatic microsporidiosis, HPM），感染后沒(méi)有明顯的臨床癥狀，攝食正常，腸道飽滿，沒(méi)有大批量死亡。2～3 個(gè)月后病蝦表現(xiàn)為生長(zhǎng)速度緩慢甚至停止生長(zhǎng)，體型大小差異明顯，約50%左右的染病蝦體質(zhì)量增長(zhǎng)到4～5 g 時(shí)再無(wú)變化。嚴(yán)重感染時(shí)，病蝦腸道出現(xiàn)發(fā)炎，解剖發(fā)現(xiàn)其肝胰腺萎縮病變、發(fā)軟、顏色變深，少數(shù)病蝦還會(huì)出現(xiàn)白便癥狀[11]。

取感染蝦的血淋巴進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)其總蛋白量和白蛋白量顯著上升，堿性磷酸酶（alkalinephos phatase, ALP）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（asparate transaminase,AST）和谷丙轉(zhuǎn)氨酶（alanine transaminase, ALT）等肝損傷指標(biāo)數(shù)值顯著高于健康蝦[12]。由此可知EHP會(huì)引起肝胰腺病變，從而導(dǎo)致肝胰腺功能受損。

3 感染機(jī)制

EHP 無(wú)法在細(xì)胞外進(jìn)行繁殖，只能寄生在細(xì)胞內(nèi)部，因此其感染方式也比較獨(dú)特。目前普遍認(rèn)為極管是EHP 感染宿主細(xì)胞的主要細(xì)胞器[13]。極管是以螺旋形盤繞在孢子內(nèi)部的一種管狀結(jié)構(gòu)，由極管蛋白組成且具有彈性。當(dāng)孢子進(jìn)入宿主體內(nèi)時(shí)，由于外界環(huán)境的刺激，孢子內(nèi)部壓力急劇增大，極管外翻并彈出，刺破宿主細(xì)胞膜，然后將孢原質(zhì)注射進(jìn)宿主細(xì)胞內(nèi)部[14]。孢原質(zhì)在新的細(xì)胞中增殖循環(huán)，最終產(chǎn)生新的孢子，從而實(shí)現(xiàn)孢子的繁殖和遺傳物質(zhì)的復(fù)制[15]。

4 傳播途徑

傳播是寄生蟲感染宿主群體并完成生活史的重要環(huán)節(jié)之一。EHP 的傳播有兩種途徑：水平傳播和垂直傳播。

4.1 水平傳播

大多數(shù)微孢子蟲都具有致病性，且大多通過(guò)水平傳播方式感染脊椎和無(wú)脊椎宿主[16]。EHP 的水平傳播途徑相對(duì)復(fù)雜，既可以通過(guò)攝食傳播，即健康蝦攝食被EHP 污染的飼料或餌料、病死蝦殘?bào)w以及養(yǎng)殖水環(huán)境中的孢子體而被感染[17]；也可以通過(guò)養(yǎng)殖水體傳播，即健康蝦生活在含有EHP 孢子的養(yǎng)殖水體中被感染[18]。

4.2 垂直傳播

垂直傳播是指EHP 通過(guò)母體宿主傳遞到子代宿主，通過(guò)宿主的繁殖實(shí)現(xiàn)自身傳播。2018 年Vukhac等[19]給親蝦投喂已感染的蝦組織，在無(wú)節(jié)幼體中發(fā)現(xiàn)了EHP 的感染，第一次證明EHP 可以在凡納濱蝦類中垂直傳播，并根據(jù)這個(gè)結(jié)果建立了一種針對(duì)蝦類幼體EHP 檢測(cè)的PCR 方法。

5 檢測(cè)方法

EHP 的檢測(cè)有多種方法，顯微鏡技術(shù)、細(xì)胞培養(yǎng)方法、動(dòng)物模型等方法都可檢測(cè)到[20]。但由于EHP個(gè)體微小，光學(xué)顯微鏡觀察蟲體形態(tài)的方法很難直接判斷，因此常采用組織學(xué)或分子生物學(xué)方法來(lái)對(duì)EHP 進(jìn)行確切的診斷。

5.1 組織學(xué)方法

病理檢測(cè)是目前臨床醫(yī)學(xué)最為可靠的一種定性診斷，可通過(guò)組織石蠟切片，蘇木精-伊紅（HE）染色，顯微觀察，最終發(fā)現(xiàn)組織病理變化，準(zhǔn)確判斷病因[21]。目前常用的組織染色法有HE 染色法、甲苯胺藍(lán)（TB）染色法、Masson 染色法、普魯士藍(lán)（PB）染色法、愛(ài)顯藍(lán)-雪夫（AB-PAS）染色法、偉郝夫范吉森（EVG）染色法、勞克堅(jiān)牢藍(lán)（LFB）染色法和天狼猩紅（Sirius red）染色等[1]。常曉晴等[21]對(duì)以上8 種染色方法進(jìn)行比較，綜合分析染色效果及檢出率，發(fā)現(xiàn)Masson 染色法效果最佳。然而，組織學(xué)方法檢驗(yàn)耗時(shí)長(zhǎng)，制作流程繁瑣，且肝腸胞蟲含量低時(shí)極易漏診，因此，現(xiàn)在主要將其用作臨床診斷的輔助工具。

5.2 分子生物學(xué)方法

與組織學(xué)方法相比，分子生物學(xué)方法更靈敏、更快速、特異性更強(qiáng)，是目前實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)EHP 最常使用的技術(shù)手段。目前常用的分子生物學(xué)方法主要有普通PCR 檢測(cè)法、環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)（Loopmediated isothermal amplification, LAMP）、地高辛標(biāo)記核酸探針原位雜交法、巢式PCR、實(shí)時(shí)熒光定量PCR 法等，這些方法在快捷程度和靈敏度上各有優(yōu)劣。

5.2.1 環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù) 環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)是一種新型核酸擴(kuò)增技術(shù)，具有特異性強(qiáng)、敏感性高、成本低廉的優(yōu)點(diǎn)。因其操作簡(jiǎn)單、檢測(cè)速度快，常用于現(xiàn)場(chǎng)的快速檢測(cè)。孫妍等[22]比較了LAMP方法和常規(guī)PCR 方法在檢測(cè)EHP 靈敏度方面的差異，發(fā)現(xiàn)該方法檢出限為3.71 個(gè)質(zhì)?？截?μL，靈敏度是普通PCR 的100 倍。

5.2.2 原位雜交技術(shù)（ISH） ISH 是一種比PCR 法靈敏度更高，且可以定位和相對(duì)定量檢測(cè)EHP 的方法。該方法利用核酸分子單鏈之間互補(bǔ)的堿基序列，將探針與待測(cè)DNA 或RNA 結(jié)合成專一的核酸雜交分子，經(jīng)一定手段將其顯現(xiàn)出來(lái)[23]。Tang 等[24]采用該方法特異性的檢出了凡納濱對(duì)蝦組織、糞便和養(yǎng)殖水體中存在的EHP。不足的是該方法操作繁瑣且費(fèi)時(shí)。

5.2.3 PCR 檢測(cè)法 普通PCR 方法只進(jìn)行一次特異性片段的擴(kuò)增，容易出現(xiàn)假陽(yáng)性，因此很難準(zhǔn)確的判斷EHP 感染[25]。巢式PCR 作為一種變異的聚合酶鏈反應(yīng)，通過(guò)兩輪PCR 反應(yīng)，增強(qiáng)了檢測(cè)的特異性和敏感度。Amornrat 等[17]擴(kuò)增了EHP SSU rDNA 基因并且構(gòu)建了系統(tǒng)進(jìn)化樹，建立了EHP 的一種巢式PCR 檢測(cè)方法，證明了EHP 不是凡納濱對(duì)蝦白便綜合征的原因。Jaroenlak 等[25]針對(duì)EHP 的胞外蛋白基因進(jìn)行了鑒定和基因組測(cè)序，并以此建立了一種新的巢式PCR 檢測(cè)方法，即靈敏度更高的SWP-PCR 法。

實(shí)時(shí)熒光定量PCR（Quantitative Real-time PCR）是利用熒光信號(hào)的積累實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)PCR 進(jìn)程，然后對(duì)未知模板進(jìn)行定量分析的檢測(cè)方法。目前已建立的實(shí)時(shí)熒光定量PCR 方法根據(jù)使用所使用的熒光物質(zhì)不同分為TaqMan 探針?lè)ê蚐YBR Green I 熒光染料法兩種，更常用的是操作簡(jiǎn)單且成本低的SYBR Green I 熒光染料法。駱云慧等[26]建立了靈敏度比常規(guī)PCR 高10 倍的TaqMan 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 檢測(cè)方法，該方法對(duì)EHP 標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒的檢測(cè)靈敏度為5.2×102copies/μL，可滿足高通量檢測(cè)。劉珍等[5]優(yōu)化了熒光定量PCR 反應(yīng)條件，建立了檢測(cè)靈敏度比普通巢式PCR 高約4 倍的SYBR Green I 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 檢測(cè)方法。該方法簡(jiǎn)單快速且靈敏度高，避免了因樣品的代表性和靈敏度而造成的誤診問(wèn)題。

6 防治措施

EHP 的出現(xiàn)，嚴(yán)重危害著蝦類養(yǎng)殖，國(guó)內(nèi)外學(xué)者也對(duì)其防治措施進(jìn)行了大量的研究。但由于EHP的嚴(yán)格細(xì)胞寄生，其成熟的孢子壁有一層極堅(jiān)硬的幾丁質(zhì)外殼，外源性藥物很難見效，目前還未發(fā)現(xiàn)有效的治療藥物[27]。因此對(duì)于EHP 的防治應(yīng)“防重于治，防治結(jié)合”雙管齊下，根據(jù)實(shí)際情況，對(duì)養(yǎng)殖過(guò)程中的每一個(gè)可能感染EHP 的環(huán)節(jié)做好風(fēng)險(xiǎn)防控，多方面實(shí)施預(yù)防手段，進(jìn)而減少EHP 的感染。

6.1 嚴(yán)格的清塘處理

有機(jī)質(zhì)豐富的池塘?xí)oEHP 的中間宿主提供適宜的生存環(huán)境，因此在放苗前，要對(duì)池塘進(jìn)行徹底的清塘處理，尤其是曾經(jīng)感染過(guò)EHP 的養(yǎng)殖池溏。處理方式包括對(duì)池塘底泥進(jìn)行翻耕，并用氫氧化鈉、生石灰等強(qiáng)堿性物質(zhì)對(duì)塘底消毒，從而破壞大部分微孢子蟲適宜的生存環(huán)境，排除蝦EHP 存在的隱患[20]。

6.2 育苗生物安全

選擇優(yōu)質(zhì)的蝦苗進(jìn)行繁殖和培育，繁殖前要進(jìn)行嚴(yán)格且正規(guī)的檢測(cè)。培育親蝦的培育池及日常養(yǎng)殖使用的工具，在正式使用之前要確保清潔干凈。做好池塘的清淤消毒，之后還要進(jìn)行干燥處理。以上措施雖不能完全消滅EHP，但可以降低EHP 的數(shù)量水平。

6.3 加強(qiáng)池塘管理

池塘水質(zhì)的穩(wěn)定對(duì)于蝦類的養(yǎng)殖尤為重要，因此要對(duì)池塘進(jìn)行嚴(yán)格的管理。應(yīng)主要從以下幾個(gè)方面加強(qiáng)管理：①要及時(shí)撈出病蝦、死蝦，防止健康蝦殘食；②及時(shí)清理蝦的排泄物和代謝產(chǎn)物，避免污染水質(zhì)，導(dǎo)致進(jìn)一步的交叉污染；③可以在飼料中添加一些保肝護(hù)腸道的產(chǎn)品，改善蝦的體質(zhì)，防止寄生蟲感染腸道；④蝦類養(yǎng)殖用水在使用前，需經(jīng)過(guò)蓄水池沉淀、砂濾、曝氣、消毒等處理；養(yǎng)殖過(guò)程中產(chǎn)生的廢水，必須要經(jīng)過(guò)科學(xué)處理后，排放到指定的地點(diǎn)，防止擴(kuò)大污染；⑤要根據(jù)實(shí)際養(yǎng)殖情況對(duì)池塘定期換水，必要時(shí)可向池中添加一些水質(zhì)凈化劑[28]。⑥降低池水鹽度一定程度上可預(yù)防蝦EHP的傳播。

7 展望

蝦類養(yǎng)殖集約化是未來(lái)發(fā)展大勢(shì)所趨，但高密度養(yǎng)殖卻加快了疾病的流行和傳播。目前EHP 對(duì)我國(guó)蝦類養(yǎng)殖已造成了不可估量的危害，但其生活史、與宿主之間的聯(lián)系以及孢子萌發(fā)機(jī)制等問(wèn)題都沒(méi)有得到完全的解決。因此，在未來(lái)的研究工作中，應(yīng)加強(qiáng)蝦類養(yǎng)殖環(huán)境的保護(hù)與治理，加快優(yōu)質(zhì)蝦類苗種的繁育工作，改進(jìn)EHP 檢測(cè)和預(yù)防技術(shù)，并盡快研制治療EHP 的有效藥物，以保障蝦類養(yǎng)殖的健康發(fā)展。