論文：丁香酚的分離及其殺多子小瓜蟲活性研究

丁香酚的分離及其殺多子小瓜蟲活性研究

姚嘉赟，徐 洋，袁雪梅，藺凌云，尹文林,潘曉藝，郝貴杰，沈錦玉

( 浙江省淡水水產(chǎn)研究所，農(nóng)業(yè)部淡水漁業(yè)健康養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江省魚類健康與營養(yǎng)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江 湖州，313001 )

利用不同極性大小的溶劑石油醚、乙酸乙酯、氯仿、甲醇回流提取丁香制備粗提物，進(jìn)行殺滅多子小瓜蟲幼蟲和包囊的藥效活性追蹤，確定丁香殺蟲的活性部位為石油醚提取部分，進(jìn)而利用硅膠柱層析和中壓制備液相等分離技術(shù)結(jié)合活性追逐試驗(yàn)追蹤分離丁香石油醚提取物(對(duì)多子小瓜蟲幼蟲和包囊的100%致死質(zhì)量濃度分別為50 mg/L和80 mg/L)，最終分離獲得一種殺蟲活性物質(zhì)，經(jīng)質(zhì)譜、核磁氫譜、核磁碳譜等多種波譜分析技術(shù)確定該活性物質(zhì)為丁香酚。體外殺蟲結(jié)果表明，丁香酚對(duì)多子小瓜蟲具有較強(qiáng)的殺滅作用，其對(duì)幼蟲15 min、1 h、2 h、3 h和4 h的半數(shù)致死質(zhì)量濃度分別為6.21 (5.85～6.65) mg/L、3.50 (3.24～3.84) mg/L、2.90 (2.62～3.22) mg/L、2.33 (2.10～2.50) mg/L 和2.15 (1.98～2.32) mg/L，對(duì)幼蟲4 h的100%殺滅的質(zhì)量濃度為3.5 mg/L，對(duì)包囊6 h的100%殺滅質(zhì)量濃度為3.5 mg/L。結(jié)果表明，丁香酚是一種具有較好開發(fā)前景的殺多子小瓜蟲藥物。

丁香酚；多子小瓜蟲；活性追蹤；殺蟲活性

多子小瓜蟲(Ichthyophthiriusmultifilis)，屬纖毛門、寡膜綱、膜口目、凹口科、多子小瓜蟲屬，是一種世界性分布的淡水魚類專性寄生蟲，其幾乎能感染所有的淡水魚類，患多子小瓜蟲病的魚死亡率很高，一旦患有多子小瓜蟲病就難以治愈，因此多子小瓜蟲病被稱為魚類的“癌癥”，給我國乃至世界的淡水魚類養(yǎng)殖業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失[1]。

對(duì)于多子小瓜蟲病的防治，國內(nèi)外已做了大量的研究工作，倪達(dá)書[2]在20世紀(jì)60年代就篩選出用醋酸亞汞治療多子小瓜蟲病，并對(duì)醋酸亞汞的治療機(jī)理和治療用量都做了闡述。但由于醋酸亞汞的毒性強(qiáng)，早已被禁止在食用魚上使用。同樣，對(duì)多子小瓜蟲病療效較好的孔雀石綠，也因?yàn)閷?duì)人體有致癌性和毒性，已被禁止在食用魚上使用[3]。近年來國內(nèi)對(duì)多子小瓜蟲病治療的研究也比較多，如用辣椒和生姜、五倍子、食鹽、生石灰等治療多子小瓜蟲，但這些藥物大多數(shù)對(duì)掠食體階段有一定效果，而對(duì)滋養(yǎng)體階段效果不明顯。國外用于防治多子小瓜蟲病的藥物和方法也較多，甲醛[4]、葉綠酸[5]、溴硝醇[6]、高錳酸鉀[7]和高鐵酸鉀[8]等，但這些藥物和方法都受到一定的限制，對(duì)多子小瓜蟲的滋養(yǎng)體和包囊階段效果不明顯。同時(shí)，長期使用帶來的環(huán)境污染、藥物殘留、耐藥性等一系列問題，也成為目前食品安全和水產(chǎn)品出口的綠色貿(mào)易壁壘問題，因此，尋找對(duì)多子小瓜蟲病的治療行之有效、環(huán)境友好型藥物是一項(xiàng)迫在眉睫的任務(wù)。

天然植物資源作為自然資源的一大寶庫，蘊(yùn)藏著巨大的潛力，具有結(jié)構(gòu)新穎、功能多樣性的活性物質(zhì)，因此在有效創(chuàng)制醫(yī)藥、獸藥和農(nóng)藥等新藥及探索具有生物活性的先導(dǎo)化合物等方面越來越受到重視和青睞。同時(shí)，具有低毒、低殘留、對(duì)非靶標(biāo)生物毒害較低，對(duì)環(huán)境無污染等優(yōu)點(diǎn)，可降低或避免目前化學(xué)藥物帶來的“藥物公害”。筆者也一直致力于從天然植物中尋找新型的殺蟲藥物，利用提取分離技術(shù)從天然植物博落回和小果博落回中分離到3 種化合物血根堿[9]、二氫血根堿和二氫白屈菜紅堿[10]，對(duì)多子小瓜蟲具有較強(qiáng)的殺滅作用。前期篩選中，發(fā)現(xiàn)丁香的提取物具有殺多子小瓜蟲的作用，因此本研究利用提取分離技術(shù)并結(jié)合殺蟲活性追蹤法分離丁香中的殺蟲活性成分，并對(duì)其結(jié)構(gòu)進(jìn)行鑒定，為開發(fā)新的殺蟲藥物奠定基礎(chǔ)，并為尋求新的殺蟲母體藥源，研究殺蟲活性成分并進(jìn)行仿生合成提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 藥材

丁香(Eugeniacaryophyllata)購自安徽中藥材市場。

1.1.2 試驗(yàn)用魚

金魚(Carassiusauratus)，體長(7.4±1.8) cm，嚴(yán)重感染多子小瓜蟲，購自湖州市花鳥魚蟲市場，草魚(Ctenopharynodonidellus)體質(zhì)量(13.8±2.7) cm，來自浙北水產(chǎn)新品種繁育技術(shù)開發(fā)有限公司。

1.2 儀器與試劑

R-210/215型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(瑞士Buchi)，Olympus-BX51顯微鏡(日本)，石油醚、乙酸乙酯、氯仿、甲醇等化學(xué)試劑均為分析純，上?；瘜W(xué)試劑有限公司提供。

1.2 方法

1.2.1 多子小瓜蟲的活體傳代

將感染有多子小瓜蟲的金魚與草魚混養(yǎng)于80 cm×60 cm×60 cm的階梯式PP循環(huán)養(yǎng)殖水槽，水溫控制為(22±1) ℃，溶解氧>5 mg/L，水體經(jīng)砂層過濾。每3日換水50%，感染約7 d，魚體表面即可出現(xiàn)密集的小白點(diǎn)，可用于多子小瓜蟲的收集以及幼蟲的培養(yǎng)，同時(shí)要注意及時(shí)加入未感染的草魚，未使用的病魚應(yīng)及時(shí)撈出以免免疫力提高而影響蟲體傳代。

1.2.2 蟲體的收集與培養(yǎng)

將嚴(yán)重感染多子小瓜蟲的草魚放置于玻璃缸中，并于玻璃缸底部放置5～10個(gè)塑料培養(yǎng)皿，待成熟蟲體黏附于培養(yǎng)皿底部后，收集蟲體。一部分蟲體用于多子小瓜蟲幼蟲(掠食體)的培養(yǎng)，一部分用于包囊的收集。

1.2.3 體外殺多子小瓜蟲幼蟲(掠食體)試驗(yàn)

藥液的配制：各提取物及活性單體經(jīng)旋轉(zhuǎn)干燥后，精確稱取10 mg，溶解于二甲基亞砜并放置于冰箱保存?zhèn)溆?。待進(jìn)行藥效試驗(yàn)時(shí)取出，并利用曝氣的自然水稀釋至所需質(zhì)量濃度后進(jìn)行體外殺蟲試驗(yàn)。

試驗(yàn)在24孔細(xì)胞培養(yǎng)板上進(jìn)行，于每個(gè)細(xì)胞孔中加入約2 mL不同質(zhì)量濃度的藥液和約100個(gè)多子小瓜蟲幼蟲，于用藥后15 min、1 h、2 h、3 h、4 h鏡檢觀察一次，4 h后統(tǒng)計(jì)各孔的多子小瓜蟲死亡率。試驗(yàn)設(shè)置二甲基亞砜對(duì)照組和充分曝氣自然水對(duì)照組，每組試驗(yàn)重復(fù)3次。

多子小瓜蟲幼蟲死亡判斷標(biāo)準(zhǔn)：蟲體纖毛不運(yùn)動(dòng)，胞質(zhì)不流動(dòng)，胞膜破裂，細(xì)胞核破碎。

1.2.4 體外殺多子小瓜蟲包囊的試驗(yàn)

試驗(yàn)在24孔細(xì)胞培養(yǎng)板上進(jìn)行，于每個(gè)細(xì)胞孔中均加入不同質(zhì)量濃度的藥液和30個(gè)多子小瓜蟲包囊，于用藥后6 h，吸出藥液，加入充分曝氣的自然水。于22 ℃下培養(yǎng)24 h后先鏡檢觀察各孔的包囊存活及蟲體孵化情況，之后將有幼蟲孵化的細(xì)胞孔利用移液槍混勻，并吸取10 μL液體用1%甲醛固定后計(jì)數(shù)，進(jìn)而計(jì)算各孔的包囊孵化蟲數(shù)。每孔取5次樣品，去平均值，試驗(yàn)設(shè)置3個(gè)重復(fù)。

包囊孵化蟲數(shù)=每孔孵化蟲體數(shù)/包囊個(gè)數(shù)

多子小瓜蟲包囊死亡判斷標(biāo)準(zhǔn)：包囊破裂、未分裂或包囊未孵出幼蟲。

1.2.5 丁香殺蟲活性部位的確定

稱取丁香粉末50 g，利用不同極性溶劑(石油醚、乙酸乙酯、氯仿、甲醇)分別進(jìn)行提取，溶劑的使用量500 mL，每次提取2 h，并合并提取液，經(jīng)減壓濃縮后用于體外殺蟲試驗(yàn)，并根據(jù)藥效結(jié)果確定丁香的殺蟲活性部位。

1.2.6 殺蟲活性追逐試驗(yàn)

稱取5 kg丁香粉，用石油醚回流連續(xù)提取3次，合并提取液，經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)后濕法上硅膠柱層析，依次用石油醚、石油醚∶乙酸乙酯、乙酸乙酯進(jìn)行梯度洗脫，每200 mL洗脫液作為一個(gè)餾分，共收集476個(gè)餾分，經(jīng)TLC合并為5個(gè)組分(FrA:1～78; FrB: 79～156; FrC: 157～268; FrD:269～378; FrE:379～476)。對(duì)這6個(gè)組分進(jìn)行體外殺蟲(掠食體和包囊)試驗(yàn)，其中FrC對(duì)多子小瓜蟲掠食體和包囊的殺滅效果最強(qiáng)，故而利用中壓制備系統(tǒng)(Flash)對(duì)FrC以石油醚∶乙酸乙酯=1∶2為洗脫劑進(jìn)行進(jìn)一步分離純化，分離獲得一種具有殺蟲活性的單體化合物，對(duì)其進(jìn)行波譜分析鑒定。

1.2.7 數(shù)據(jù)處理與分析

用SPSS 16.0處理藥效數(shù)據(jù)，以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,采用方差分析進(jìn)行差異顯著性分析。

2 結(jié) 果

2.1 丁香殺蟲活性部位的確定

丁香不同極性溶劑(石油醚、氯仿、乙酸乙酯、甲醇)提取液對(duì)多子小瓜蟲幼蟲的殺滅作用見表1。由表1可知，各提取液在所測的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)對(duì)多子小瓜蟲幼蟲均具有一定的殺滅作用，且隨著溶劑極性的增大其殺蟲效果逐漸降低。而殺蟲效果最好的為石油醚提取物，其質(zhì)量濃度為50.0 mg/L時(shí),在4 h即可殺滅100%幼蟲，而甲醇的殺蟲效果最差，其質(zhì)量濃度為80 mg/L時(shí)殺滅率為30.0%。各提取物對(duì)多子小瓜蟲的殺滅活性的順序則依次是石油醚>乙酸乙酯提取物>氯仿提取物>甲醇提取物。

丁香不同極性溶劑(石油醚、氯仿、乙酸乙酯、甲醇)提取液對(duì)多子小瓜蟲包囊的殺滅作用見表2。由表2可知，各提取液對(duì)多子小瓜蟲的包囊均具有殺滅或抑制作用，且隨著溶劑極性的增大其殺蟲效果逐漸降低。而殺蟲效果最好的為石油醚提取物，其質(zhì)量濃度為80.0 mg/L時(shí)可100%殺滅包囊，而甲醇提取物的效果最差，其質(zhì)量濃度為80.0 mg/L時(shí)包囊的死亡率為30%。各提取物對(duì)多子小瓜蟲的殺滅活性的順序則依次是石油醚>乙酸乙酯提取物>氯仿提取物>甲醇提取物。

通過上述試驗(yàn)，確定丁香殺多子小瓜蟲的活性部位為丁香的石油醚提取部位，對(duì)該部位進(jìn)行進(jìn)一步的分離。

圖1 丁香4種不同極性溶劑提取物對(duì)多子小瓜蟲幼蟲的殺滅作用(4 h)注：PE-E：石油醚提取物；CL-E：氯仿提取物；EA-E：乙酸乙酯提取物；ME-E：甲醇提取物.

質(zhì)量濃度/mg·L-1死亡率/%孵化蟲數(shù)/個(gè)·包囊-1質(zhì)量濃度/mg·L-1死亡率/%孵化蟲數(shù)/個(gè)·包囊-100.0±0.0a656.7±45.2a00.0±0.0a656.7±45.2a石油醚提取物20.026.7±3.3b684.3±55.7a氯仿提取物20.00.0±0.0a666.2±63.2a40.056.7±6.7c617.1±33.5a40.013.3±6.7b638.6±39.3a60.083.3±3.3d205.3±38.5b60.033.3±3.3d543.6±35.0b80.0100±0.00e0.00±0.00c80.043.3±6.7e341.5±22.8c乙酸乙酯提取物20.013.3±3.3b661.1±55.5a甲醇提取物20.00.0±0.0a651.3±33.7a40.026.7±3.3c633.4±41.0a40.00.0±0.0a628.7±46.3a60.040.0±6.7d611.5±28.0a60.010.0±0.0b615.3±45.7a80.060.0±6.7e436.3±24.5a80.030.0±2.2c433.3±35.3b

注：字母表示與對(duì)照組差異顯著(P<0.05).

2.2 殺蟲活性成分的結(jié)構(gòu)鑒定

對(duì)丁香石油醚提取物進(jìn)行進(jìn)一步的提取分離后獲得一種對(duì)多子小瓜蟲幼蟲和包囊均具有較好殺滅作用的單體化合物，該化合物為黃色液體，有芳香氣味，溶于乙醇、乙醚、氯仿，極微溶于水。對(duì)該化合物進(jìn)行波譜分析：EI-MS m/z:165[M++1];1H-NMR (CDCl3 )δ 6.76 (1H, d,J = 8.0 Hz,H-6) ,6.74 (1H, dd,J= 8.02.0 Hz,H-5) ,6.70(1H, d,J= 2.0 Hz,H-3),5.92(1H,ddt,J= 16.0,10.0, 0.7, 0 Hz, H-8), 5.05(2H, m, H-9a,9b), 3.80 (3H,s,2-OCH),3.28 (2H,d,J=7.0 Hz,H-7);13C-NMR(CDCl3)δ 147.9(C-1), 148.9(C-2), 111.9(C-3), 133.1(C-4), 120.65(C-5), 112.3(C-6), 39.8(C-7), 137.4(C-8), 115.8(C-9), 56.2(2-OCH3)。上述圖譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[11]基本一致，故鑒定該化合物丁香酚。

2.3 丁香酚對(duì)多子小瓜蟲的殺滅作用

丁香酚對(duì)多子小瓜蟲幼蟲的殺滅作用見圖2。由圖2可知，丁香酚對(duì)多子小瓜蟲具有較強(qiáng)的殺滅作用，隨著質(zhì)量濃度的增加其殺滅作用逐漸增強(qiáng)。其15 min、1 h、2 h、3 h 和 4 h的半數(shù)致死質(zhì)量濃度(95% 置信區(qū)間) 分別為6.21 (5.85～6.65) mg/L、3.50 (3.24～3.84) mg/L、2.90 (2.62～3.22) mg/L、2.33 (2.10～2.50) mg/L 和 2.15 (1.98～2.32) mg/L，其質(zhì)量濃度為3.5 mg/L時(shí)，對(duì)多子小瓜蟲幼蟲的殺滅率為100%。

圖2 丁香酚對(duì)多子小瓜蟲幼蟲的殺滅作用4 h

丁香酚對(duì)多子小瓜蟲幼蟲的殺滅作用見表2。由表2可知，丁香酚作用多子小瓜蟲包囊后，可顯著抑制包囊的分裂，其質(zhì)量濃度為16.0 mg/L時(shí)，包囊未分裂，沒有幼蟲孵化，提示其可100%殺滅包囊。而8.0 mg/L和12.0 mg/L質(zhì)量濃度組均有幼蟲浮出，但其蟲體孵化數(shù)分別為(435.1±12.6)個(gè)/包囊和(222.5±26.5)個(gè)/包囊，均顯著低于對(duì)照組(598.5±38.0)個(gè)/包囊。

包囊抑制試驗(yàn)結(jié)果還顯示，丁香酚對(duì)多子小瓜蟲的包囊的結(jié)構(gòu)具有極大的破壞作用。16.0 mg/L試驗(yàn)組經(jīng)6 h作用后，多子小瓜蟲的包囊結(jié)構(gòu)完全破壞，胞質(zhì)外流，細(xì)胞核不可見。而對(duì)照組包囊結(jié)構(gòu)完好，且分裂完全(圖3)。

表2 丁香酚對(duì)多子小瓜蟲包囊的成活和孵化影響(6 h)

圖3 丁香酚作用多子小瓜蟲包囊后的顯微結(jié)構(gòu)a：丁香酚作用6 h后；b：正常分裂包囊.40×.

3 討 論

3.1 丁香的殺小瓜蟲活性部位

天然植物因其源于自然，具有易降解、不易產(chǎn)生耐藥性、生物安全性高且結(jié)構(gòu)多樣性的優(yōu)點(diǎn)而越來越受新藥研究者的重視，并逐漸成為研究的熱點(diǎn)。中藥活性部位篩選，多根據(jù)化合物結(jié)構(gòu)“相似相溶”的原理，采用極性由弱漸強(qiáng)的不同溶劑進(jìn)行系統(tǒng)提取[12]，進(jìn)而在相同條件下進(jìn)行部位活性比較試驗(yàn)來判斷活性部位。本研究通過石油醚、氯仿、乙酸乙酯、甲醇等4種溶劑對(duì)丁香進(jìn)行系統(tǒng)提取，發(fā)現(xiàn)其殺多子小瓜蟲的高效活性成分主要存在于石油醚提取物中，同時(shí)本研究也主要針對(duì)石油醚提取部位進(jìn)行追蹤分離純化，并分離得到一種單體化合物，經(jīng)波譜分析鑒定為丁香酚，其對(duì)多子小瓜蟲幼蟲的100%殺滅的質(zhì)量濃度為3.5 mg/L，其殺蟲效果明顯優(yōu)于從博落回中分離到的二氫血根堿和二氫白屈菜紅堿[10]，以及從五倍子中分離到五沒食子酰葡萄糖[13]，說明丁香酚具有較強(qiáng)的殺蟲活性和較廣的應(yīng)用的前景。同時(shí)，天然植物化學(xué)成分比較復(fù)雜，有些成分具有較高的活性成分，但是其在植物中的含量極低，故而可能在初篩中體現(xiàn)不出活性優(yōu)勢，因而本研究中乙酸乙酯提取物和氯仿提取物也表現(xiàn)一定的殺蟲活性，可能存在的更好殺蟲活性成分。

3.2 丁香酚殺蟲作用及機(jī)理

丁香酚即4-烯丙基-2-甲氧基苯酚，又稱子丁香酚，廣泛存在于丁香酚、肉桂葉油、樟腦油等芳香油中[14]。在水產(chǎn)養(yǎng)殖中丁香酚主要作為麻醉劑，在魚類親魚采卵、活魚運(yùn)輸過程中應(yīng)用[15-16]。而在醫(yī)藥上，具有抑菌、麻醉、解熱、抗氧化、抗腫瘤、促進(jìn)透皮吸收、驅(qū)蚊等多種藥理活性[17-19]，本研究發(fā)現(xiàn)丁香酚具有較強(qiáng)的殺多子小瓜蟲的作用，這是首次發(fā)現(xiàn)該化合物具有殺水產(chǎn)動(dòng)物寄生蟲功能。張杰等[20]在研究丁香酚對(duì)灰葡萄孢(Botrytiscinerea)孢子細(xì)胞膜透性中發(fā)現(xiàn)，在短時(shí)間(15 min)內(nèi)丁香酚即可破壞菌絲細(xì)胞膜的通透性，使菌絲細(xì)胞膜對(duì)K+的選擇通透性增加，隨著處理時(shí)間延長，細(xì)胞破裂，進(jìn)而可能導(dǎo)致蛋白質(zhì)及其他大分子物質(zhì)的外流情況。Gill等[21]發(fā)現(xiàn)丁香酚能抑制李斯特菌(Listeriamonocytogenges)和沙克乳酸桿菌(Lactobacillussakei)的三磷酸腺苷酶活性，進(jìn)而影響其能量代謝。Usta等[22]研究表明，丁香酚可抑制小鼠肝臟細(xì)胞膜上Na+/K+-三磷酸腺苷酶活性，進(jìn)而影響K+運(yùn)輸，打破膜內(nèi)外濃度平衡，進(jìn)而導(dǎo)致內(nèi)外物質(zhì)交換失衡細(xì)胞損傷。而本研究丁香酚對(duì)包囊的研究結(jié)果也顯示，其可導(dǎo)致多子小瓜蟲包囊的破裂，其作用機(jī)理也可能是改變了包膜上通透性或某些物質(zhì)的運(yùn)輸進(jìn)而導(dǎo)致包膜破裂，但其具體的作用位點(diǎn)、作用模式和作用機(jī)制還需進(jìn)一步研究。

筆者從丁香中提取到一種對(duì)多子小瓜蟲具有較好殺滅作用的活性物質(zhì)丁香酚，從植物中提取丁香酚的提取率高，成本低，且該化合物結(jié)構(gòu)比較簡單較易合成。因此，丁香酚有望成為一種高效、低毒、環(huán)保型的綠色水產(chǎn)動(dòng)物殺蟲劑，具有廣闊的開發(fā)利用前景。