淺論天然產(chǎn)物防治魚類小瓜蟲病的研究

小瓜蟲病是由多子小瓜蟲（簡(jiǎn)稱小瓜蟲）寄生于淡水魚體表和鰓上引起的危害嚴(yán)重的魚類原蟲病之一。然而，自特效藥物（孔雀石綠和汞鹽）被禁止使用以來，絕大部分化學(xué)藥物通過殺死離體階段小瓜蟲達(dá)到防治目的，但在體抗蟲效果有限且會(huì)對(duì)魚體產(chǎn)生毒性，食品安全、環(huán)境污染等一系列問題限制了其進(jìn)一步的使用。天然產(chǎn)物具有易降解、對(duì)非靶標(biāo)生物毒性低、環(huán)境友好、資源豐富等優(yōu)點(diǎn)，是安全無公害水產(chǎn)抗寄生蟲藥的理想來源。

近年來，天然產(chǎn)物用于防治小瓜蟲病得到了廣泛關(guān)注。研究者發(fā)現(xiàn)了一系列中草藥提取物以及植物源化合物呈現(xiàn)出極強(qiáng)的抗小瓜蟲效果，但是對(duì)環(huán)境的影響和毒性也同樣需要注意。這些天然產(chǎn)物的抗小瓜蟲效果如下所述，并且離體及在體的相關(guān)研究結(jié)果匯總在表1以及相應(yīng)化合物結(jié)構(gòu)展示在圖1中。

Yao等（2011）通過對(duì)小果博落回葉使用三氯甲烷抽提后純化出兩種有效抗蟲活性成分，分別為二氫血根堿和二氫白屈菜紅堿，對(duì)離體階段的小瓜蟲有較強(qiáng)的抗蟲活性，EC50分別為5.18mg/L和9.43mg/L；而兩種化合物對(duì)于赤眼鱒的急性毒性（LC50）分別為13.3mg/L和18.2mg/L。Yi等（2012）從30種中草藥篩選發(fā)現(xiàn)厚樸和苦豆子甲醇提取物，對(duì)小瓜蟲滋養(yǎng)體、包囊和掠食體均有很好的效果，苦豆子甲醇提取物濃度320mg/L時(shí)，對(duì)小瓜蟲包囊的致死率達(dá)到100%；而厚樸甲醇提取物效果更優(yōu)，10.0mg/L的提取物4h內(nèi)可100%殺死小瓜蟲掠食體，20.0mg/L的提取物處理小瓜蟲包囊20h后可完全阻止掠食體的產(chǎn)生，并且使用40.0mg/L的提取物浸泡患病金魚1h后可將小瓜蟲掠食體的繁殖數(shù)量降低約50%。

Shan等（2014）從飛龍掌血中分離得到的白屈菜紅堿和茵芋堿分別在濃度為1.2mg/L和3.5mg/L時(shí)4h內(nèi)能100%殺滅離體階段的小瓜蟲；在體試驗(yàn)表明，分別用1.8mg/L和8.0mg/L的兩種化合物可顯著減少寄生金魚的小瓜蟲數(shù)量；而白屈菜紅堿對(duì)金魚的急性毒性（LC50）為3.3mg/L。Zhang等（2013）對(duì)五倍子分離純化后，得到活性化合物五沒食子酰葡萄糖，在使用濃度為2.5mg/L～20.0mg/L處理6min～234min對(duì)小瓜蟲掠食體有100%的殺滅作用；用1.0mg/L、2.0mg/L和5.0mg/L的五沒食子酰葡萄糖能顯著降低小瓜蟲的感染率，且在濃度為20mg/L能夠有效治療患病的斑點(diǎn)叉尾鮰并阻止小瓜蟲感染幼魚；該化合物對(duì)斑點(diǎn)叉尾鮰的LC50值為151.3mg/L。

Ling等（2013）在進(jìn)行中草藥提取物抗原蟲的試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，補(bǔ)骨脂的甲醇提取物濃度為1.25mg/L時(shí)4h內(nèi)對(duì)小瓜蟲掠食體的致死率達(dá)100%；且5.0mg/L的提取物能100%殺死包囊前體以及88.89%的包囊；提取物成功阻止小瓜蟲感染的最小濃度為1.2mg/L；使用5.0mg/L的提取物浸泡患病金魚24h可顯著降低小瓜蟲的存活和繁殖。另一項(xiàng)研究顯示，Song等（2015）從補(bǔ)骨脂中分離得到的補(bǔ)骨脂定及異補(bǔ)骨脂素分別進(jìn)行離體及在體抗小瓜蟲活性試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)補(bǔ)骨脂定是最有效的。在4h內(nèi)完全殺滅掠食體的濃度為0.8mg/L；分別用0.9mg/L處理包囊前體或1.2mg/L處理包囊可以終止其繁殖；此外，2.5mg/L的補(bǔ)骨脂定浸泡患病金魚5h能顯著降低小瓜蟲掠食體的產(chǎn)生數(shù)量。

白桑樹的根皮用以研究其潛在的抗小瓜蟲效果。Fu等（2014a）采用不同的提取方法從樹皮粉末中分離活性物質(zhì)，但其離體有效抗蟲濃度要比提到的其它測(cè)試藥物高很多。此外，在另一項(xiàng)研究中，Liang等（2015）從桑樹根皮中得到的兩種類黃酮（桑黃酮G和O）使用濃度超過2.0mg/L可以100%殺死小瓜蟲掠食體并且在處理后能降低掠食體的感染力，桑黃酮G和O對(duì)草魚的半數(shù)致死濃度分別為38.0mg/L和26.9mg/L。

圖1 具有抗小瓜蟲活性的植物源化合物化學(xué)結(jié)構(gòu)式匯總（1）二氫血根堿 （2）二氫白屈菜紅堿 （3）白屈菜紅堿（4）茵芋堿 （5）五沒食子酰葡萄糖 （6）補(bǔ)骨脂定（7）異補(bǔ)骨脂素 （8）桑黃酮G （9）桑黃酮O（10）纖細(xì)薯蕷皂苷 （11）盾葉新苷 （12）白薇苷-C（13）白薇苷-A （14）蔓生白薇苷C （15）姜黃素（16）大黃素 （17）厚樸酚

分離自植物閉鞘姜的纖細(xì)薯蕷皂苷和盾葉新苷展現(xiàn)出很好的離體及在體抗小瓜蟲活性。Zheng等（2015）發(fā)現(xiàn)濃度分別為0.8mg/L和4.5mg/L的纖細(xì)薯蕷皂苷和盾葉新苷可以100%致死小瓜蟲掠食體，而兩種化合物分別在1.0mg/L和5.0mg/L時(shí)能夠在處理6小時(shí)后完全殺死小瓜蟲包囊前體及包囊；在體試驗(yàn)表明濃度分別為1.0mg/L和5.0mg/L的纖細(xì)薯蕷皂苷和盾葉新苷極大地提高了患病草魚的存活率并能減少寄生的滋養(yǎng)體數(shù)量；兩者的急性毒性（LC50）分別為1.64mg/L和20.7mg/L。

三種植物白薇、姜、徐長(zhǎng)卿的乙醇提取物，分別進(jìn)行抗小瓜蟲掠食體、包囊前體和包囊的活性試驗(yàn)，并通過飼料添加用于治療已感染的草魚。濃度為8.0mg/L的姜提取物能100%致死小瓜蟲掠食體，4.0mg/L的白薇提取物可以完全殺死小瓜蟲包囊，但添加在飼料中的提取物發(fā)揮效果有限（Linetal.2016）。另一項(xiàng)研究表明，F(xiàn)u等（2014b，2015）從白薇中分離出的白薇苷-C在較低濃度0.25mg/L約5h能100%殺死離體階段的小瓜蟲。相同的濃度用于在體感染試驗(yàn)，仍然有很好的保護(hù)和治療效果。此外，在毒性試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，對(duì)草魚的半數(shù)致死濃度（LC50）為46.8mg/L，因此認(rèn)為可以安全地用于防治小瓜蟲病。Wen等（2017）從中藥徐長(zhǎng)卿中分離到兩種抗小瓜蟲活性化合物白薇苷-A和蔓生白薇苷C，兩種化合物均在10.0mg/L時(shí)100%致死小瓜蟲掠食體，在8.0mg/L時(shí)都能完全殺死小瓜蟲包囊；用濃度為15.0mg/L的兩種化合物浸泡患病金魚10d均能顯著降低寄生的滋養(yǎng)體數(shù)量。

Liu等（2017）報(bào)道來自姜黃的姜黃素在濃度為1.0mg/L時(shí)21.7min能100%致死小瓜蟲掠食體，且在31.0min內(nèi)用8.0mg/L的姜黃素可完全殺死小瓜蟲包囊；而4.0mg/L的姜黃素處理16h能完全阻止包囊的繁殖；同時(shí)，患病草魚在4.0mg/L的姜黃素中浸泡10d后被完全治愈并且該濃度可使幼魚免遭小瓜蟲感染；姜黃素對(duì)草魚96h的LC50值為56.8mg/L。

近期，Zhou等（2018）從植物虎杖中分離到的抗小瓜蟲活性化合物大黃素，用1.0mg/L的大黃素96min能殺滅所有小瓜蟲掠食體；盡管在濃度等于或小于0.5mg/L無法完全致死掠食體，但預(yù)處理2h可顯著降低掠食體的感染力；使用濃度為1.0mg/L和2.0mg/L的大黃素能夠分別終止小瓜蟲包囊前體及包囊的繁殖；在體試驗(yàn)中，添加0.5mg/L的大黃素浸泡10d可治愈患病草魚并有效保護(hù)幼魚不被感染；而其對(duì)草魚的半數(shù)致死濃度為3.15mg/L。Song等（2018）研究發(fā)現(xiàn)天然化合物厚樸酚作為中草藥厚樸中的主要活性成分之一，在殺滅小瓜蟲上有較好的效果，由于其化學(xué)結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，易于人工合成和修飾改造，是進(jìn)行藥物開發(fā)的理想先導(dǎo)化合物。當(dāng)厚樸酚濃度大于0.6mg/L時(shí)能導(dǎo)致100%的小瓜蟲掠食體死亡；濃度為0.8mg/L的厚樸酚，可導(dǎo)致約48%的包囊前體無法發(fā)育成包囊，且不能進(jìn)一步繁殖；而當(dāng)厚樸酚濃度大于1.0mg/L時(shí)，所有包囊均不能繁殖出掠食體。在體試驗(yàn)表明，1.5mg/L的厚樸酚浸泡患病金魚5h后可使小瓜蟲繁殖力下降約40%。此外，通過形態(tài)學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)，厚樸酚可以直接破壞小瓜蟲細(xì)胞膜的完整性，并抑制小瓜蟲二分裂繁殖。

以上大部分藥物對(duì)離體的小瓜蟲均有較好的殺滅活性，但直接對(duì)寄生在魚類身上的小瓜蟲進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)探究較少。滋養(yǎng)體階段的小瓜蟲外面包被一層較厚的宿主保護(hù)層，對(duì)藥物相對(duì)不敏感，只有離體階段的小瓜蟲對(duì)藥物較敏感。天然產(chǎn)物對(duì)幼蟲期、包囊期的小瓜蟲殺滅效果明顯，有效藥物也較多，亟須積極開發(fā)能作用于滋養(yǎng)體階段小瓜蟲的藥物。大多數(shù)中草藥提取物抗蟲活性一般，且提取工藝復(fù)雜、成本較高；而天然化合物即便擁有良好的抗蟲活性，但由于產(chǎn)率低或化學(xué)結(jié)構(gòu)復(fù)雜無法進(jìn)行人工合成，從而限制了其進(jìn)一步地開發(fā)和利用。同時(shí)，對(duì)天然產(chǎn)物藥效、毒力及藥理作用尚未進(jìn)行細(xì)致深入的研究，大多數(shù)天然產(chǎn)物作用機(jī)制尚不明確。開發(fā)出一款防治小瓜蟲病安全、高效、廉價(jià)的替代藥物，還需要研究者們不斷地努力。

表1 近年來天然產(chǎn)物離體及在體抗小瓜蟲活性研究匯總表