27種中草藥提取物對刺激隱核蟲的殺蟲活性研究

刺激隱核蟲（Cryptocaryon irritans），隸屬于纖毛動物門，隱核蟲屬，亦稱海水刺激隱核蟲（Ichthyophthirius）。它幾乎可以感染所有的海水魚類，且感染性強(qiáng)，傳播性廣，感染率、死亡率都極高，一旦感染幾乎無藥可治，它給我國乃至世界的海水養(yǎng)殖業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失，也是目前限制海水養(yǎng)殖的一大技術(shù)瓶頸，因此其防治技術(shù)一直以來是海水養(yǎng)殖魚類中的研究熱點和焦點。

目前對刺激隱核蟲具有較好作用的是孔雀石綠和硝酸亞汞，但是因其具有致癌作用已被禁用。之后甲醛、硫酸銅、過氧化氫、過氧乙酸、過碳酸鈉、溴硝醇等被用于控制刺激隱核蟲病，雖有一定的功效，但長期使用帶來的是環(huán)境污染、藥物殘留、耐藥性等一系列問題，也成為當(dāng)前食品安全和水產(chǎn)品出口的綠色貿(mào)易壁壘問題，引起社會各界普遍關(guān)注。因此，尋找對刺激隱核蟲病行之有效、環(huán)境友好的藥物是一項迫在眉睫的任務(wù)。

中草藥是天然藥物，因其具有無抗藥性、無副作用、不引發(fā)藥源性疾病，同時天然產(chǎn)物具有化學(xué)結(jié)構(gòu)多樣性，生物活性豐富等優(yōu)勢。利用天然植物開發(fā)水產(chǎn)藥物，具有低毒、低殘留、對非靶標(biāo)生物毒害較低，對環(huán)境無污染等優(yōu)點，可降低或避免目前化學(xué)藥物帶來的“藥物公害”，使用植物源漁藥，完全符合漁藥的發(fā)展方向，同時從天然植物中分離殺蟲活性成分，尋找新的殺蟲活性物質(zhì)或藥物前體，進(jìn)而進(jìn)行仿生合成，不僅是有效創(chuàng)制新藥的經(jīng)濟(jì)、快捷途徑，而且也是對植物資源的合理開發(fā)與利用。因此，利用天然植物開發(fā)能替代現(xiàn)有藥品的無公害、環(huán)保型天然植物源殺蟲藥，對綠色水產(chǎn)品的生產(chǎn)，加快漁藥研究的現(xiàn)代化水平有重要意義。本實驗對27種中草藥的水提物和醇提物篩選對刺激隱核蟲具有較好殺滅作用的中草藥，為該病的防治提供科學(xué)用藥的依據(jù)，為進(jìn)一步研制開發(fā)高效、低毒、無殘留的植物源殺蟲劑提供理論依據(jù)和技術(shù)基礎(chǔ)。

一、材料與方法

（一）供試菌株

刺激隱核蟲采自福建某大黃魚繁育基地。

（二）供試中草藥樣品

27種中草藥來自野外采集或藥材市場購買，種類分別為獨活、黃芩、金銀花、枳殼、地錦草、訶子、重樓、黃姜、石榴皮、綿馬貫眾、白果、吳茱萸、川楝子、大黃、板藍(lán)根、博落回、小果博落回、虎杖、丁香、五倍子、金櫻子、馬齒莧、百部、蛇床子、白屈菜、冬凌草、檳榔。各味中草藥經(jīng)60℃干燥后粉碎，4℃保存?zhèn)溆谩?/span>

（三）提取液的制備

本實驗采用水提和醇提2種方法對各味中草藥進(jìn)行提取。

水提法：上述供試中草藥各取50g倒入燒杯中，加500mL水，密封后放入65℃水浴鍋3h，濾出藥液，反復(fù)提取3次，合并所得濾液，濃縮至浸膏。高壓滅菌后置4℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/span>

醇提法：上述中草藥各取50g倒入圓底燒瓶中，加95%的乙醇，加入量以浸過藥材表面1cm～2cm為宜，回流提取60min，待冷卻后過濾。于藥渣中加入乙醇，作第2次回流，約0.5h，冷卻后過濾。收集2次的濾液，濃縮至浸膏，高壓滅菌后置4℃冰箱中保存待用。

（四）體外殺蟲試驗

1.蟲體的收集

將嚴(yán)重感染刺激隱核蟲的大黃魚放入燒杯中，待刺激隱核蟲游出后，用吸管將成熟刺激隱核蟲收集放入平皿中，按照本實驗室建立的方法進(jìn)行培養(yǎng)。

2.不同提取物體外殺幼蟲試驗

試驗在24孔細(xì)胞培養(yǎng)板上進(jìn)行，于每個細(xì)胞孔中加入約2mL不同濃度的藥液和約100個刺激隱核蟲幼蟲，于用藥后15min、1h、2h、3h、4h鏡檢觀察一次，4h后統(tǒng)計各孔的刺激隱核蟲死亡率。試驗設(shè)置DMSO對照組和充分暴氣自然水對照組，每組試驗重復(fù)三次。

刺激隱核蟲死亡判斷標(biāo)準(zhǔn)：蟲體纖毛不運動，胞質(zhì)不流動，胞膜破裂，細(xì)胞核破碎。

（五）數(shù)據(jù)處理

用SPSS16.0處理藥效數(shù)據(jù)，以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤表示，采用方差分析進(jìn)行差異顯著性分析。

二、結(jié)果與分析

（一）27種中草藥水提物體外殺刺激隱核蟲掠食體的結(jié)果

由表1可知：27種中藥水提物中石榴皮、綿馬貫眾、白果、博落回、小果博落回、五倍子和白屈菜具有較強(qiáng)的殺蟲作用，其中博落回和小果博落回的作用最強(qiáng)，其濃度為60.0mg/L時，可100%殺死刺激隱核蟲掠食體，其對掠食體的半數(shù)致死濃度分別為12.1mg/L和12.5mg/L。

（二）27種中草藥醇提物體殺滅刺激隱核蟲掠食體的結(jié)果

由表2可知：27種中藥醇提物中濃度低于100mg/L就能抑制包囊孵化的天然植物有訶子、重樓、綿馬貫眾、白果、博落回、小果博落回和白屈菜，其中博落回和小果博落回的作用最強(qiáng)，其濃度為50.0mg/L時，可100%殺滅刺激隱核蟲掠食體。

三、討論

天然植物中的化學(xué)成分十分復(fù)雜，一種植物體內(nèi)往往含有多種抗菌活性成分，且它們之間與有機(jī)體之間往往呈現(xiàn)十分復(fù)雜的相互作用，因此不易產(chǎn)生耐藥性。所以植物源成為創(chuàng)制無公害綠色新漁藥的重要途徑之一，不但直接利用植物資源，而且可進(jìn)一步分離獲得殺蟲活性分子、仿生合成漁用原料藥。

表1 27種中草藥水提物對刺激隱核蟲掠食體的殺滅作用

表2 27種中草藥醇提物對刺激隱核蟲掠食體的殺滅作用

本研究對27種植物中草藥體外殺刺激隱核蟲的活性進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)多種植物具有較好的體外殺蟲活性。同時結(jié)果顯示這幾味中草藥的水提物和醇提物體外殺刺激隱核蟲掠食體的效果具有一定的差異性，如石榴皮的水體物對刺激隱核蟲掠食體具有較好的殺滅作用，而其醇提物則沒有作用或者作用較弱。這主要可能是因為不同溶劑提取物所包含的物質(zhì)不同，故而所含的活性物質(zhì)也具有差異性。

博落回和小果博落回是罌粟殼植物，前期研究表明這兩種天然藥物具有抗菌、消炎、殺蟲等生物活性，其主要活性物質(zhì)可能是血根堿、二氫血根堿和二氫白屈菜紅堿。