食品微生物檢測：菌落總數(shù)測定標(biāo)準(zhǔn)要點解析

一、稱樣

  （1）一般稱量25g，由于稱樣量較大，標(biāo)準(zhǔn)中對于稱樣的準(zhǔn)確性未作出明確規(guī)定，微生物室常用稱樣的電子天平最大允許誤差為±0.1g，一般遵循“宜多不宜少”的原則，即實際稱樣時可根據(jù)樣品情況稱取超出25g（如硬質(zhì)糖果等，檢驗人員應(yīng)依據(jù)樣品實際情況決定如何稱樣）；

  （2）對于部分食品添加劑已明確須稱取1.0g的，則須嚴(yán)格精確稱量。

二、樣品稀釋

  （1）固體或半固體：稱取25g樣品于均質(zhì)袋中，加入已滅菌的生理鹽水225g，稍捏碎（特別是糕點/面包及其他淀粉制品），放入拍擊式均質(zhì)器均質(zhì)1min，此時即制備成1：10的樣品勻液。以移液器或滅菌吸取該液體至9mL滅菌生理鹽水試管中，換上新的滅菌移液器槍頭，緩緩吸取液體后反復(fù)吹打2次，此時即制備成1：100的勻液，以此類推，制備10倍系列稀釋勻液。

  （2）液體樣品：直接吸取原液進(jìn)行檢驗，稀釋時可直接吸取1mL原液到9mL滅菌生理鹽水試管中按照“固體或半固體”的方式稀釋。

三、稀釋度的選取

  液體樣品可直接取原液進(jìn)行檢驗；固體或半固體則必須依據(jù)檢驗經(jīng)驗，選取2-3個適宜稀釋度進(jìn)行檢驗（一般樣品選取1：10，1：100，1：1000三個稀釋度進(jìn)行檢驗。若遇到不常做的樣品，可適當(dāng)延長稀釋度至1：100000甚至1：1000000）。

四、質(zhì)量控制

  空白對照：分別吸取1mL滅菌生理鹽水到平皿中做空白對照。（若空白有菌落生長則該實驗無效）。

五、平板計數(shù)瓊脂（PCA）

  滅菌條件為121℃、15min。一般情況下于500mL敞口錐形瓶（三角瓶）中配制400mL/瓶。

六、

  有時樣品基質(zhì)比較特殊，樣品勻液有細(xì)小的顆粒與菌落不易區(qū)分，此時可采用如下方法進(jìn)行區(qū)分：

 （1）配制1%的2,3,5-三苯基氯化四氮唑溶液（又稱紅四唑或紅四氮唑，簡稱TTC），高壓滅菌后避光冷藏備用。紅四唑滅菌條件為：121℃、20min；

 （2）待PCA瓊脂培養(yǎng)基冷卻至適宜傾注溫度時，無菌加入上述TTC溶液2mL，充分搖勻（此時PCA中TTC濃度為0.005%）。

  加入TTC的目的及注意事項：培養(yǎng)后，菌落被TTC染成紅色，而樣品顆粒不變色，方便計數(shù)；PCA中TTC的濃度不宜過高，否則會抑制微生物的生長，對實驗結(jié)果產(chǎn)生影響。（特殊情況下方添加TTC，常規(guī)實驗無須添加，特別是對于菌落數(shù)量較少的樣品不宜添加。方法來源依據(jù)為《化妝品衛(wèi)生規(guī)范》中菌落總數(shù)測定相關(guān)章節(jié)）

七、稀釋液

  常采用0.85%氯化鈉溶液（生理鹽水），121℃、15min高壓滅菌后冷卻備用。

八、

  傾注培養(yǎng)基時，根據(jù)對樣品污染情況的估計（同一類型樣品的微生物檢測經(jīng)驗），若樣品有表面蔓延生長的可能性，則待第一次傾注的瓊脂凝固后，可在表面再覆蓋一層瓊脂以避免菌落蔓延而難以計數(shù)。

九、

  水產(chǎn)品30±1℃培養(yǎng)72±3h；其它樣品36±1℃培養(yǎng)48±2h。注意：此處的“水產(chǎn)品”是指生魚片、魷魚干等未經(jīng)深度加工的水產(chǎn)品。

十、

  本標(biāo)準(zhǔn)的重難點為菌落計數(shù)及計算。除標(biāo)準(zhǔn)中已說明的要求外，有以下幾點需要注意：

 （1）菌落計數(shù)時，從低稀釋度的平板開始計數(shù)。若所有平板上的菌落數(shù)均小于30CFU，則須計數(shù)所有平板上的菌落數(shù)，但僅采用最接近30CFU的兩個平板的菌落數(shù)來計算最終菌落總數(shù)。

  以固體樣品舉例，菌落數(shù)選取、計算過程及結(jié)果修約如下：

 （2）當(dāng)?shù)谝幌♂屘荻纫粋€板上菌落數(shù)高于30，另一個低于30，則依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)當(dāng)以介于30-300之間的菌落數(shù)作為該稀釋梯度的菌落數(shù)。（存在爭議，實際遇到該類情況時應(yīng)謹(jǐn)慎對待）

  以固體樣品舉例，菌落數(shù)選取、計算過程及結(jié)果修約如下：

 （3）若所有平板上的菌落數(shù)均大于30CFU，則只計數(shù)30-300CFU之間的平板上的菌落數(shù)，并采用這些數(shù)據(jù)，依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)中給定的公式，進(jìn)行最終菌落總數(shù)的計算，此時將大于300CFU的記為“多不可計”，以“TNTC”表示。

  以固體樣品舉例，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)中給定的公示，菌落數(shù)選取、計算過程及結(jié)果修約如下：

 （4）若所有稀釋度的平板菌落數(shù)都大于300，則不能所有都計為TNTC，必須將最高稀釋度的兩個平板上的菌落逐一地計數(shù)，再計算平均數(shù)，該平均數(shù)為該梯度的菌落總數(shù)，其余平板上的菌落數(shù)可記為TNTC。

  以固體樣品舉例，菌落數(shù)選取、計算過程及結(jié)果修約如下：

 （5）計算菌落總數(shù)時，須嚴(yán)格按照標(biāo)準(zhǔn)要求進(jìn)行計算。

  特殊情況：

  ①若所有平板均無菌落生長，則以小于1乘以最低稀釋倍數(shù)。“最低稀釋倍數(shù)”并不是固定不變的，與檢驗人員選取的稀釋度有關(guān)。如：某樣品多次檢驗后發(fā)現(xiàn)菌落總數(shù)較高，檢驗人員在梯度稀釋后取1:1000、1:10000、1:100000三個梯度的稀釋液傾注平板，最終所有平板上的均無菌落生長，則計算過程為＜1×1000，最終結(jié)果為＜1000CFU；若選取1:10、1:100、1:1000三個梯度的稀釋液傾注平板，均無菌落生長，則最終結(jié)果為＜10CFU。因此，稀釋度的選擇對于結(jié)果存在較大影響，選擇時應(yīng)謹(jǐn)慎。

  ②最低稀釋度兩個平板只有一個平板上長了1個菌落，若為固體樣品且本次檢驗的最低稀釋倍數(shù)為1:10，此時計算過程為（1+0）/2×10=5，由于默認(rèn)固體樣品最小檢出量為10CFU，故本次檢驗的菌落總數(shù)結(jié)果為10CFU。注意：對于該情況一直存在爭議，不同的檢驗人員可能做法不一，有人保留為5CFU，有人保留為10CFU，并無固定做法。（建議檢驗人員保持一貫做法，不要隨意更改）

  舉例如下：

十一、

  對于水產(chǎn)品、冷凍食品、速凍食品等菌落總數(shù)含量較高、限量值較大的食品類別，建議多增加稀釋梯度（可稀釋至10-4甚至10-5），避免稀釋度較低、濃度較大導(dǎo)致培養(yǎng)后平板上菌落蔓延、彌散而難以計數(shù)甚至無法計數(shù)。