南極磷蝦原肌球蛋白純化鑒定、理化特性及模擬表位肽預測

原肌球蛋白（TM）存在于除植物以外的所有真核細胞中，被證明是一種交叉反應過敏原，在無脊椎動物家族中被認為是泛變應原，在蝦等多個物種中被確定為主要過敏原。它是一種高度保守蛋白，平均長度約為284 個氨基酸殘基，由兩個平行的α-螺旋組成，分子質(zhì)量約34～38 kDa。TM是引起食物性過敏反應的第三大常見原因。

大連工業(yè)大學食品學院的王 珊、孫 娜*等以南極磷蝦（Euphausia superba）為主要研究對象，通過除肌漿蛋白、丙酮除脂、蛋白粗提、熱處理除雜、等電點沉淀、硫酸銨鹽析等多個步驟對其進行提取純化；利用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）和超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用（UPLC-MS/MS）技術(shù)對目的蛋白進行相關鑒定；對南極磷蝦TM進行熱穩(wěn)定性實驗、pH值穩(wěn)定性實驗和體外模擬胃腸消化實驗；根據(jù)歐洲分子生物學實驗室-歐洲生物信息研究所（EMBL-EBI）分析比對不同甲殼動物TM的氨基酸序列同源性；同時結(jié)合5種常用的生物信息學分析工具對南極磷蝦TM模擬表位肽進行預測，并利用SWISS-MODEL服務器對其空間結(jié)構(gòu)進行同源建模；最終通過PyMOL軟件將預測出的候選表位在其空間結(jié)構(gòu)上進行一一映射。

1、南極磷蝦TM的提取純化分析

如圖1所示，南極磷蝦肉經(jīng)磷酸緩沖液去除肌漿蛋白、丙酮溶液除脂、抽提液粗提、熱處理除雜、等電點沉淀、硫酸銨鹽析等多步提取純化操作，不斷去除雜條帶。根據(jù)泳道6目的蛋白條帶與Marker條帶的比對發(fā)現(xiàn)，最終僅在32 kDa附近得到單一條帶。利用Image J軟件對其進行灰度掃描分析，得到提取純化的蛋白純度達93.24%。研究表明，TM分子質(zhì)量約34～38 kDa，等電點約4.5，是一種對熱穩(wěn)定的蛋白。因此，經(jīng)一系列提取純化后最終在32 kDa附近得到的蛋白條帶很可能是南極磷蝦TM。

2、目的蛋白UPLC-MS/MS分析

如圖2所示，根據(jù)MS掃描結(jié)果初步確定目的蛋白的肽段數(shù)量及出峰位置，進而對所得肽段進行MS/MS掃描確定其氨基酸序列，共鑒定到89 條肽段，通過數(shù)據(jù)庫檢索發(fā)現(xiàn)該89 條肽段均屬于UniProt數(shù)據(jù)庫中收錄的A7VKE0蛋白（E. superba，TM），將鑒定到肽段的氨基酸數(shù)目與該蛋白總氨基酸數(shù)目相比得到其肽段覆蓋率達97%，從而確定提取純化得到的目的蛋白為南極磷蝦TM，登錄號為A7VKE0，蛋白分子質(zhì)量為32.6 kDa。

3、南極磷蝦TM性質(zhì)分析

南極磷蝦TM熱穩(wěn)定性分析

由圖3a可知，溫度由20 ℃逐漸升至100 ℃的過程中，TM條帶保持穩(wěn)定，均未發(fā)生降解，也無其他新的條帶生成。熒光光譜技術(shù)用于檢測蛋白內(nèi)源熒光，通過分析光譜峰位、強度等變化進而推斷蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)的變化。

由圖3b可知，隨溫度的升高，南極磷蝦TM在295 nm波長處的熒光強度逐漸增強。溫度由20 ℃升至60 ℃的過程中，熒光強度變化幅度不大；值得注意的是當溫度升至70 ℃時，熒光強度有較大程度提升；加熱至80 ℃時，熒光強度明顯增強，且直至上升至100 ℃時，熒光強度逐漸達到峰值，此間變化不再明顯。這說明隨著溫度的升高，南極磷蝦TM高級結(jié)構(gòu)逐漸伸展，溫度上升至70 ℃時，其內(nèi)部疏水區(qū)域暴露可能增多，加熱至80 ℃時，TM多肽鏈進一步伸展，使得疏水基團暴露程度大幅提高，熒光強度明顯增強。圓二色光譜技術(shù)被廣泛應用于分析蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)組成和變化。

由圖3c可知，南極磷蝦TM在190 nm波長附近有一正譜帶，在208 nm和222 nm波長附近有兩個負譜帶，且在溫度為20 ℃時其橢圓度絕對值最大；隨著加熱溫度的升高其橢圓度絕對值逐漸減弱，說明α-螺旋相對含量逐漸降低；然而，加熱溫度超過80 ℃的TM冷卻至室溫后其橢圓度絕對值又有一定幅度的增強。

由圖3d可知，南極磷蝦TM主要由α-螺旋和少量無規(guī)卷曲結(jié)構(gòu)組成；加熱溫度由20 ℃逐漸升至60 ℃時，α-螺旋相對含量逐漸降低，無規(guī)卷曲含量總體呈升高趨勢，但變化幅度較緩；當溫度升至70 ℃時，α-螺旋相對含量明顯下降至最低，此時β-折疊相對含量明顯增加；加熱至80 ℃時，其結(jié)構(gòu)組成與70 ℃時變化不大，無規(guī)卷曲相對含量最多，說明此溫度下TM二級結(jié)構(gòu)較為松散；值得注意的是加熱溫度自80 ℃后，α-螺旋相對含量略有回升，說明經(jīng)高溫加熱冷卻后，TM的α-螺旋結(jié)構(gòu)有一定恢復。

南極磷蝦TM的pH值穩(wěn)定性分析

由圖4a可知，pH值由1.0逐漸升至13.0的過程中，TM條帶始終穩(wěn)定存在，在其下方均沒有生成其他小分子降解條帶。

由圖4b可知，pH 5.0時，TM的熒光強度最強；pH值升至7.0時，熒光強度略有下降；隨著pH值向更酸/堿的方向變化，熒光強度逐漸降低，且堿性條件下熒光強度較酸性條件下更低。這些說明南極磷蝦TM在pH值接近其等電點（pH 4.5）時結(jié)構(gòu)較穩(wěn)定，經(jīng)酸/堿處理后可能導致發(fā)色基團暴露的微環(huán)境發(fā)生變化，TM結(jié)構(gòu)可能發(fā)生部分聚集或折疊，使部分氨基酸殘基被包埋，且pH值偏離等電點程度越大其結(jié)構(gòu)變化越嚴重，因此導致熒光強度的改變。

由圖4c可知，pH 5.0時，TM在208 nm和222 nm波長處的橢圓度絕對值最大；經(jīng)酸/堿處理后，橢圓度絕對值逐漸減弱，說明α-螺旋逐漸減少，蛋白構(gòu)象發(fā)生改變。

由圖4d可知，pH 5.0時，南極磷蝦TM的α-螺旋相對含量最高，且結(jié)構(gòu)僅由α-螺旋和少量無規(guī)卷曲組成；當pH值向酸/堿方向變化時，α-螺旋相對含量逐漸降低，β-折疊和無規(guī)卷曲逐漸增多；pH 13.0時，還出現(xiàn)了少量β-轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)。

南極磷蝦TM的體外模擬胃腸消化穩(wěn)定性分析

由圖5a可知，南極磷蝦TM在模擬胃液消化2 min開始出現(xiàn)降解，消化5 min時，出現(xiàn)較明顯的降解條帶；隨著消化反應的進行TM條帶逐漸變淺下移，隨之產(chǎn)生一系列小分子降解條帶，多集中于17～20 kDa之間；消化至120 min時，TM條帶仍未完全降解。

由圖5b可知，隨著模擬胃液消化反應的進行，TM在295 nm波長處的熒光強度在消化0.5 min時出現(xiàn)上升而后逐漸降低，在355 nm處產(chǎn)生一新峰，且熒光發(fā)射波長出現(xiàn)紅移。說明在胃消化反應初期，TM構(gòu)象可能發(fā)生伸展導致部分疏水區(qū)域暴露，隨著消化時間的延長，其結(jié)構(gòu)又重新且不斷折疊變化，在此過程中可能有新的芳香族氨基酸側(cè)鏈暴露出來。

由圖5c可知，TM在190 nm波長附近的峰的橢圓度逐漸降低，且在208 nm和222 nm波長處的峰的橢圓度絕對值逐漸減弱，說明α-螺旋不斷減少。

由圖5d可知，隨著模擬胃液消化，TM的α-螺旋相對含量整體呈下降趨勢，β-折疊相對含量整體呈增加趨勢，無規(guī)卷曲含量總體變化不大。這說明TM經(jīng)胃液消化后蛋白結(jié)構(gòu)發(fā)生部分折疊，但二級結(jié)構(gòu)總體組成變化不明顯。

由圖6a可知，南極磷蝦TM在隨即進行的模擬胃-腸消化反應中被進一步降解，生成一系列分子質(zhì)量更小的降解條帶，主要集中在11～20 kDa之間；消化反應進行到60 min時，TM條帶開始變得模糊；消化至120 min時，TM幾乎被消化完全，條帶基本消失。

由圖6b可知，在模擬胃-腸消化反應初期，TM在295 nm波長處的熒光強度迅速大幅降低，隨后在295 nm和355 nm波長附近的熒光強度也不斷下降，且在355 nm波長處出現(xiàn)輕微紅移。表明TM在胰/糜蛋白酶作用下發(fā)生高度水解產(chǎn)生一系列小分子肽段，其結(jié)構(gòu)迅速發(fā)生改變，而后這些水解肽段可能在分子相互作用下又重新形成聚集體掩埋了部分熒光發(fā)色基團，從而導致熒光猝滅；同時，構(gòu)象改變又可能使部分新的芳香族氨基酸殘基暴露引起紅移。

TM模擬胃-腸消化的圓二色光譜圖顯示出明顯改變，如圖6c所示：自消化0.5 min起，在208 nm和222 nm波長處的雙負峰帶消失，轉(zhuǎn)為在200 nm波長附近的單負峰帶，且譜線總體有藍移的趨勢。這說明經(jīng)模擬胃-腸消化后，南極磷蝦TM的α-螺旋結(jié)構(gòu)完全消失、β型結(jié)構(gòu)增加，且體系的親水性降低、疏水性增高。

由圖6d可知，南極磷蝦TM剛進入模擬胃-腸消化體系時，α-螺旋結(jié)構(gòu)就被完全破壞并消失，無規(guī)卷曲和β-轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)增多；β-折疊在整個消化過程中經(jīng)歷了減少-增加-減少等的動態(tài)變化，最終完全消失。這說明經(jīng)過模擬胃-腸消化，南極磷蝦TM的二級結(jié)構(gòu)有序性降低，消化過程中結(jié)構(gòu)發(fā)生動態(tài)變化，最終僅由大量無規(guī)卷曲和部分β-轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)組成。

4、南極磷蝦TM氨基酸序列同源性分析

如圖7所示，南極磷蝦TM與太平洋磷蝦TM的序列同源性高達98.2%，與斑節(jié)對蝦、凡納對蝦等其他蝦的TM序列同源性多數(shù)在88%以上，而與鋸緣青蟹、腐食酪螨、水蚤等序列同源性稍低，分布在82%～88%之間。很多研究發(fā)現(xiàn)甲殼類動物TM具有高度保守的氨基酸序列，同源性在88%～100%，這種高度的序列同源性很可能正是甲殼類物種之間臨床交叉反應發(fā)生頻率高的原因。

5、生物信息學預測南極磷蝦TM模擬表位肽

表1列出了各生物信息學工具預測出的過敏原表位區(qū)域。然而，每種軟件單獨使用時都會有一定的局限性，因此，綜合分析5種生物信息學工具的預測結(jié)果，同一表位被識別的軟件越多，則其準確性可能越高，將不少于3種工具共同預測出的過敏原表位確定為南極磷蝦TM候選模擬表位肽，如表2所示。共篩選得到8 條南極磷蝦TM線性模擬表位肽序列，分別為EAQNKETNAKADKADDEVH、DLERSEERLN、TKLAEASQAADESER、EADRKYDE、ERAEERAEAG、VSEEKANQREEAYKEQI、RSVQKLQKEVDR、VNEKEKYKGI。

具體表位信息如表3所示。對比發(fā)現(xiàn)，不同甲殼類TM間具有相似的表位序列，這很可能是它們彼此間具有高度過敏交叉反應性的原因之一。本研究預測得到的南極磷蝦TM模擬表位肽與這些已經(jīng)驗證的甲殼類TM抗原表位相比顯示出了較高的重疊率，對于其中部分表位序列具有高覆蓋率，這說明本研究的預測結(jié)果可能具有較高的準確性；但對于模擬表位肽中某些氨基酸的組成及序列長度等方面與這些已被鑒定出的抗原表位仍具有一定差異。

6、南極磷蝦TM空間結(jié)構(gòu)建模及模擬表位肽映射分析

如圖8所示，通過SWISS-MODEL服務器對南極磷蝦TM進行同源建模，采用序列近似度達55.99%的1c1g.2.A為模板，最終預測得到由兩條肽鏈平行纏繞而成的α-螺旋構(gòu)型的南極磷蝦TM空間結(jié)構(gòu)（圖8a）。通過服務器自帶的Structure Assessment模塊對建模得到的TM空間結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性進行評價，結(jié)果顯示高達98.05%骨架的φ角和ψ角分布于可靠區(qū)，僅有0.53%分布于異常區(qū)（圖8b）。因此，預測的南極磷蝦TM空間結(jié)構(gòu)模型是穩(wěn)定可靠且具有高質(zhì)量。

南極磷蝦TM模擬表位肽映射結(jié)果如圖9所示。利用PyMOL軟件將生物信息學工具最終預測出的南極磷蝦TM的8 條模擬表位肽在其空間結(jié)構(gòu)對應位置一一進行映射，可以看出候選模擬表位肽均勻分布在整個蛋白質(zhì)中，且多位于α-螺旋內(nèi)。

結(jié)論

本研究提取純化得到了較為純凈的南極磷蝦TM；同時利用多種生物信息學工具對其模擬表位肽的預測，不僅進一步增加了研究者對南極磷蝦TM過敏原的認識，也極大程度上提高了結(jié)果的準確性；通過對其空間結(jié)構(gòu)的預測及模擬表位肽的映射為過敏原表位的定位縮小了范圍，使得定位更加精準。本研究為未來基于南極磷蝦TM表位的相關研究提供了科學參考，不過對其準確的過敏原表位及其致敏性評價還需進一步實驗驗證。