論文：飼料中膽汁酸添加水平對(duì)牛蛙肝臟化學(xué)組成、抗氧化和代謝酶活力的影響

飼料中膽汁酸添加水平對(duì)牛蛙肝臟化學(xué)組成、抗氧化和代謝酶活力的影響

胡田恩1，王玲1，張春曉1，宋凱1，曲玲1，李金寶2

(1.集美大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院，廈門市飼料檢測(cè)與安全評(píng)價(jià)重點(diǎn)試驗(yàn)室，福建廈門361021；

2.山東龍昌動(dòng)物保健品有限公司，濟(jì)南250062)

摘要：試驗(yàn)將144只(初始質(zhì)量75.01 g±4.23 g)牛蛙(Ranacatesbeiana)隨機(jī)分在12個(gè)玻璃水族缸中，每組3個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)12只牛蛙。分別向每千克基礎(chǔ)飼料中添加0、100、200和300 mg膽汁酸，配制成4種等氮等能的試驗(yàn)飼料。試驗(yàn)期8周。結(jié)果表明：1)飼料中添加100 mg/kg的膽汁酸顯著降低肝臟粗脂肪含量，升高水分含量。2)隨著膽汁酸添加量的增加，超氧化物歧化酶(SOD)呈先升高后降低的趨勢(shì)，添加量為200 mg/kg時(shí)最高；添加膽汁酸顯著提高了谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(GSH-Px)活力；添加200 mg/kg的膽汁酸顯著降低了丙二醛(MDA)含量，當(dāng)添加量為300 mg/kg，MDA顯著升高。3)肝臟谷草轉(zhuǎn)氨酶隨著膽汁酸含量的升高呈先升高后降低趨勢(shì)，其中添加量200 mg/kg時(shí)最高，各添加水平對(duì)谷丙轉(zhuǎn)氨酶活力無(wú)顯著影響；添加100和200 mg/kg膽汁酸顯著降低肝酯酶(HL)和脂蛋白酯酶(LPL)活力。4)飼料中添加300 mg/kg的膽汁酸組牛蛙肝臟顏色呈紫黑色，有白斑，肝臟質(zhì)地硬。綜上，飼料中添加適量的膽汁酸能通過(guò)調(diào)節(jié)牛蛙肝臟脂類代謝水平和抗氧化能力以維持肝細(xì)胞的正常功能，建議膽汁酸添加量以不超過(guò)200 mg/kg為宜。

關(guān)鍵詞：牛蛙(Ranacatesbeiana)；膽汁酸；肝臟；抗氧化

近年來(lái)，隨著我國(guó)高密度、集約化水產(chǎn)養(yǎng)殖模式的快速發(fā)展，越來(lái)越多的養(yǎng)殖動(dòng)物出現(xiàn)肝臟脂肪大量積累的現(xiàn)象，肝臟是動(dòng)物最重要的代謝器官之一，其損傷或病變極易造成動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)代謝失調(diào)，免疫系統(tǒng)紊亂。患有脂肪肝的水生動(dòng)物通常表現(xiàn)為應(yīng)激能力低下，死亡率高，飼料利用率低。而蛋白/能量比不合理，日糧中維生素、必需脂肪酸和膽堿等含量不足，一般被認(rèn)為是誘導(dǎo)水生動(dòng)物肝臟脂肪過(guò)度沉積的主要原因[1-3]。牛蛙(Ranacatesbeiana)具有生長(zhǎng)快、肉質(zhì)鮮美、營(yíng)養(yǎng)豐富等特點(diǎn)，其養(yǎng)殖產(chǎn)量逐年增加，2013年達(dá)到15萬(wàn)噸以上，養(yǎng)殖區(qū)域主要分布在福建、廣東、浙江等沿海地區(qū)[4]。目前國(guó)內(nèi)外對(duì)牛蛙營(yíng)養(yǎng)的研究還仍處于起步階段，已有的研究?jī)H限于牛蛙對(duì)飼料蛋白和脂肪需要量方面的相關(guān)報(bào)道，Seixas-Filho等[8]發(fā)現(xiàn)養(yǎng)殖過(guò)程中牛蛙極易發(fā)生肝臟疾病，而高密度養(yǎng)殖、高頻率投喂的養(yǎng)殖方式以及營(yíng)養(yǎng)不均衡的飼料、不穩(wěn)定的環(huán)境條件等諸多因素常引起養(yǎng)殖牛蛙肝臟病變，并可能進(jìn)一步誘導(dǎo)其他疾病的發(fā)生，所以，急需尋求一種有效的降脂護(hù)肝方法，以維護(hù)牛蛙肝臟健康，促進(jìn)牛蛙養(yǎng)殖業(yè)的可持續(xù)發(fā)展。

膽汁酸為雙親性分子,其環(huán)戊烷多氫菲核α側(cè)的羥基(-OH)、羧基(-COOH)、磺?；?-SO3H)是親水性基團(tuán),β側(cè)的甲基 (-CH3)、烴核是疏水性基團(tuán)，這種構(gòu)型使得膽汁酸具有親水和疏水的性質(zhì)。Poupon等[9]用反相高效色譜測(cè)定膽汁酸滯留時(shí)間的方法表明，膽酸(CA)、脫氧膽酸(DCA)、鵝去氧膽酸(CDCA)和石膽酸(LCA)均為疏水性膽汁酸，比較而言，豬膽酸和豬去氧膽酸是相對(duì)親水的膽汁酸，已有報(bào)道豬去氧膽酸在降脂、保護(hù)肝臟方面具有重要作用[10,11]，CDCA對(duì)改善與腸外營(yíng)養(yǎng)有關(guān)的肝臟疾病有重要作用[12]。然而，也有研究認(rèn)為CDCA有毒性，可以誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，甚至產(chǎn)生癌變[13,14]。目前，已證實(shí)膽汁酸的細(xì)胞毒性作用與其疏水性和劑量呈正相關(guān)[9,15]。而商業(yè)的膽汁酸通常是親水性膽汁酸和疏水性膽汁酸的混合物，本試驗(yàn)以牛蛙為研究對(duì)象，旨在研究飼料中添加不同劑量的膽汁酸對(duì)牛蛙的肝臟化學(xué)組成、抗氧化能力和代謝酶活力的影響，初步探索膽汁酸對(duì)牛蛙肝臟生理的影響機(jī)制，以期為牛蛙飼料中膽汁酸的合理應(yīng)用提供參考。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)飼料配方

基礎(chǔ)飼料粗蛋白約41%，粗脂肪約7%，以魚粉和豆粕為主要蛋白源，棕櫚油為主要脂肪源，面粉為主要糖源，外加多種維生素和多種礦物質(zhì)等配制而成。膽汁酸純度99.1%，其中豬膽酸和豬去氧膽酸總和78.9%，鵝去氧膽酸20.2%，由山東龍昌動(dòng)物保健品有限公司提供。分別向每千克基礎(chǔ)飼料中添加0、100、200和300 mg膽汁酸配制出4種等氮等能的試驗(yàn)飼料(表1)。原料經(jīng)粉碎機(jī)粉碎后，過(guò)60目篩，各原料按比例逐級(jí)混勻后加油揉勻，再加適量的去離子水進(jìn)一步搓勻，經(jīng)水產(chǎn)飼料膨化機(jī)制成直徑為4.0 mm 的膨化顆粒飼料，自然陰干后密封儲(chǔ)存在-20 ℃的冰箱中備用。

表1　飼料組成與營(yíng)養(yǎng)成分

注：①礦物質(zhì)混合物( mg/kg飼料)：氯化鉀，200；碘化鉀，60；硫酸鈷，100；硫酸銅，24；硫酸亞鐵，400；硫酸鋅，174；硫酸錳，78；硫酸鎂，800；亞硒酸鈉，50；沸石粉，3114。

②維生素混合物( mg/kg飼料)： 維生素B1，10；核黃素，8；鹽酸吡哆醇，10；維生素B12，0.2；維生素K3，10；肌醇，100；泛酸鈣，20；煙酸，50；葉酸，2；生物素，2；維生素A(50萬(wàn)IU)，400；維生素D3，5；維生素E(50萬(wàn)IU)，100；乙氧基喹啉，150；次粉，1135.③50%丙酸鈣和50%富馬酸。④營(yíng)養(yǎng)水平為實(shí)測(cè)值。

1.2試驗(yàn)牛蛙與飼養(yǎng)管理

試驗(yàn)牛蛙購(gòu)自廈門市同安區(qū)某養(yǎng)殖場(chǎng)的同一批孵化的牛蛙，經(jīng)食鹽消毒，暫養(yǎng)于生態(tài)實(shí)驗(yàn)室水族箱中，以試驗(yàn)基礎(chǔ)飼料飽食投喂，使之逐漸適應(yīng)試驗(yàn)飼料及養(yǎng)殖環(huán)境。暫養(yǎng)15 d后，將牛蛙饑餓24 h，挑選體格健壯、大小均勻，初始體重(75.01±4.23)g的牛蛙144只，隨機(jī)分到12個(gè)底面積0.25 m2水族箱中(長(zhǎng)×寬×高=68 cm×38 cm×36 cm)，然后將12個(gè)水族箱隨機(jī)分為4個(gè)處理，每個(gè)處理3個(gè)重復(fù)。維持缸內(nèi)水面高度在4 cm左右，每天按1.5%飽食投喂2次(8∶00，18∶00)，投喂前30 min對(duì)各缸清洗、換水。養(yǎng)殖期間溫度為(28±2) ℃，光照14 h/d，每天記錄牛蛙的攝食和死亡情況。養(yǎng)殖試驗(yàn)持續(xù)8周。

1.3樣品采集及分析測(cè)定方法

養(yǎng)殖試驗(yàn)結(jié)束后，將牛蛙禁食24 h，分別從每缸中隨機(jī)抽取3只牛蛙，用雙毀髓法處死，迅速解剖取肝臟，觀察肝臟外部形態(tài)并記錄，將3只牛蛙的肝臟合在一起，然后將其置于-80 ℃冰箱，用于測(cè)肝臟抗氧化酶、代謝酶活力和組織化學(xué)成分。

粗酶液制備 取1.0 g肝臟加入9 mL，濃度為0.7%的4 ℃的生理鹽水，10000 r/min冰浴勻漿，勻漿液于高速冷凍離心機(jī)3000 r/min離心10 min，取上清液制得粗酶液。用于測(cè)定肝臟中超氧化物歧化酶(SOD)、過(guò)氧化氫酶(CAT)、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(GSH-Px)、丙二醛(MDA)等抗氧化酶活力和谷草轉(zhuǎn)氨酶(GOT)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(GPT)、脂蛋白酯酶(LPL)、肝酯酶(HL)等代謝酶活力。其中SOD活力采用羥胺法，CAT活力采用鉬酸銨法，GSH-Px活力采用二硫代二硝基苯甲酸比色法，MDA含量采用硫代巴比妥酸(TBA)法測(cè)定，GOT和GPT活力采用賴氏法測(cè)定。肝酯酶、脂蛋白酯酶活力采用比色法測(cè)定，活力單位定義為每毫克組織蛋白每小時(shí)在反應(yīng)系統(tǒng)中所產(chǎn)生的1微摩爾(μmol)的游離脂肪酸FFA為1個(gè)酶活力單位[FFA μmol/(mg prot·h)]。以上各指標(biāo)均采用南京生物工程研究所提供的試劑盒測(cè)定，具體操作參見(jiàn)說(shuō)明書。

飼料和肝臟中水分、粗蛋白、粗脂肪和粗灰分的含量參照AOAC[16]的方法測(cè)定。粗蛋白采用凱氏定氮法(N×6.25)，用FOSS公司生產(chǎn)的Kjeltec8400型全自動(dòng)凱氏定氮儀進(jìn)行測(cè)定；粗脂肪采用索氏抽提法；粗灰分采用馬福爐550 ℃灼燒法；水分采用105 ℃恒重法。

1.4數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

試驗(yàn)數(shù)據(jù)結(jié)果經(jīng)Excel 2007初步整理后，采用SPSS19.0軟件進(jìn)行單因素方差分析(One-way ANOVA)，若差異顯著，則采用Duncan氏法進(jìn)行多重比較，差異顯著水平為P<0.05。試驗(yàn)結(jié)果均采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤(x±SE)表示。

2結(jié)果

2.1飼料中添加膽汁酸對(duì)牛蛙肝臟化學(xué)成分的影響

由表2可知，飼料中添加100 mg/kg膽汁酸時(shí)，肝臟粗脂肪含量較對(duì)照組顯著降低，當(dāng)膽汁酸添加量為200和300 mg/kg時(shí)，脂肪含量與對(duì)照組無(wú)顯著差異，而肝臟水分與脂肪變化趨勢(shì)相反。飼料中添加膽汁酸對(duì)肝臟中粗蛋白和粗灰分含量均無(wú)顯著性影響。

表2　飼料中添加膽汁酸對(duì)牛蛙肝臟化學(xué)成分的影響(n=3)

注：同行上標(biāo)小寫字母不同代表差異顯著(P<0.05)，以下各表相同。

2.2飼料中添加膽汁酸對(duì)牛蛙肝臟抗氧化酶活力和MDA含量的影響

飼料中添加膽汁酸顯著提高了肝臟谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(GSH-Px)活力。當(dāng)膽汁酸添加量為200 mg/kg時(shí)，SOD活力顯著高于其他組。丙二醛(MDA)含量呈先降低后升高的趨勢(shì)，其中當(dāng)添加量為200 mg/kg時(shí)最低，而300 mg/kg時(shí)MDA含量顯著升高。各試驗(yàn)組間肝臟CAT活力無(wú)顯著差異(表3)。

表3　飼料中添加膽汁酸對(duì)肝臟抗氧化指標(biāo)的影響(n=3)

2.3飼料中添加膽汁酸對(duì)牛蛙肝臟代謝酶的影響

由表4可知，隨著膽汁酸添加量的增加，谷草轉(zhuǎn)氨酶活力呈先升高后下降的趨勢(shì)，當(dāng)添加100 mg/kg時(shí)谷草轉(zhuǎn)氨酶活力最高，各組之間谷丙轉(zhuǎn)氨酶活力無(wú)顯著性差異。飼料中添加膽汁酸顯著影響了酯酶的活力，當(dāng)膽汁酸添加量為100和200 mg/kg時(shí)，肝酯酶和脂蛋白酯酶活力較對(duì)照組均顯著降低。

表4　飼料中添加膽汁酸對(duì)牛蛙肝臟谷草轉(zhuǎn)氨酶、谷丙轉(zhuǎn)氨酶、脂蛋白酯酶和肝酯酶活力的影響(n=3)

2.4飼料添加膽汁酸對(duì)牛蛙肝臟外部形態(tài)的影響

牛蛙解剖后發(fā)現(xiàn)腸系膜少量脂肪蓄積，肝臟大小正常，不同處理組肝臟顏色各有差異。對(duì)照組肝臟顏色淡紅，有油膩感，膽囊顏色茶褐色，有白點(diǎn)分布。100和200 mg/kg膽汁酸組牛蛙肝臟屬于正常顏色；300 mg/kg組肝臟紫黑，并出現(xiàn)大面積的白斑，解剖后用手指輕輕按壓離體肝臟，發(fā)現(xiàn)該組肝臟質(zhì)地偏硬、無(wú)彈性。

表5　牛蛙肝臟組織病理變化特征

3討論

3.1飼料中添加膽汁酸對(duì)牛蛙肝臟生化組成的影響

試驗(yàn)結(jié)果表明對(duì)照組肝臟脂肪含量為6.73%，而添加100 mg/kg膽汁酸組牛蛙肝臟脂肪含量迅速下降到4.96%，說(shuō)明飼料中添加膽汁酸有助于減少肝臟脂肪沉積，降低脂肪肝的潛在風(fēng)險(xiǎn)。已有學(xué)者表明，飼料中添加適量的膽汁酸可以降低大菱鲆(Scophthalmusmaximus)[17]、軍曹魚(Rachycentroncanadum)[18]、草魚(Ctenopharyngodonidellus)[19]肝臟脂肪含量。Gilat等[20]認(rèn)為，飽和脂肪酸能在體內(nèi)與膽酸結(jié)合形成脂肪酸-膽酸結(jié)合物(FABACs)，F(xiàn)ABACs可通過(guò)抑制羥基甲基戊二酸單酰輔酶A還原酶抑制膽固醇的合成，通過(guò)細(xì)胞色素P7A1酶介導(dǎo)的途徑促進(jìn)膽固醇向膽酸的轉(zhuǎn)化，從而通過(guò)減少膽固醇含量來(lái)降低大鼠肝組織中脂肪含量。也有資料表明膽汁酸能通過(guò)激活G蛋白偶聯(lián)膽汁酸受體(TGR5)，刺激小鼠褐色脂肪組織分解供能[21]，因此肝臟脂肪含量的降低也可能是膽汁酸作用下能量代謝增強(qiáng)的結(jié)果。也有學(xué)者報(bào)道[11]，脫氧膽酸作為脂肪酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(FATP5)活力的一種抑制劑，而FATP5主要功能是促進(jìn)長(zhǎng)鏈游離脂肪酸(LCFA)向肝臟的轉(zhuǎn)運(yùn)，脫氧膽酸可以利用這種機(jī)制限制過(guò)多的LCFA的攝入，說(shuō)明膽汁酸可通過(guò)減少脂肪酸的來(lái)源進(jìn)而減少脂肪在肝臟的沉積。然而，疏水性膽汁酸具有細(xì)胞毒性，Song等[15]研究發(fā)現(xiàn)鵝脫氧膽酸對(duì)肝臟的毒性與劑量有關(guān)，當(dāng)飼料中CDCA濃度為0~0.3 %時(shí)小鼠未表現(xiàn)出明顯毒理癥狀，高于0.3%時(shí)毒性明顯。本研究中，當(dāng)膽汁酸添加量為200和300 mg/kg時(shí)，脂肪含量與對(duì)照組并無(wú)差異，但較100 mg/kg組顯著升高，可能是其中的疏水性膽汁酸在一定程度上抑制線粒體的氧化磷酸化水平，降低胞內(nèi)ATP合成速率[22]，從而降低脂質(zhì)的分解代謝。本試驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明飼料中添加膽汁酸對(duì)牛蛙肝臟脂肪含量的影響有明顯的劑量效應(yīng)，應(yīng)當(dāng)開(kāi)展進(jìn)一步研究確認(rèn)牛蛙飼料中膽汁酸對(duì)其肝臟作用的具體機(jī)制。

3.3膽汁酸對(duì)牛蛙肝臟抗氧化能力影響

動(dòng)物細(xì)胞生存需要適當(dāng)?shù)难趸c抗氧化平衡，當(dāng)自由基產(chǎn)生量超過(guò)機(jī)體的抗氧化能力時(shí)，就會(huì)造成氧化損傷[23]?？寡趸冈隗w內(nèi)能構(gòu)成一個(gè)重要的清除活性氧簇(ROS)的防御系統(tǒng)，SOD以超氧陰離子(O2·-)為底物，將其還原成H2O2，而H2O2繼而可被CAT分解為水和氧氣，也可被GSH-Px分解成水[24]。已有研究發(fā)現(xiàn)高濃度的疏水性膽汁酸具有細(xì)胞毒性，易造成部分肝臟機(jī)能的降低或缺失，影響SOD酶的生成，并且當(dāng)機(jī)體受到嚴(yán)重脅迫時(shí)也會(huì)抑制SOD基因的表達(dá)[25]。本研究中，添加300 mg/kg膽汁酸時(shí)，牛蛙肝臟SOD活力顯著降低，說(shuō)明300 mg/kg的添加水平可能對(duì)試驗(yàn)牛蛙肝臟細(xì)胞產(chǎn)生毒性，從而降低SOD的活力。然而，在本研究中，200 mg/kg膽汁酸組牛蛙肝臟的SOD活力顯著高于對(duì)照組，說(shuō)明該劑量的膽汁酸對(duì)肝細(xì)胞沒(méi)有明顯的毒副作用，并且能提高牛蛙的抗氧化能力，抑制自由基產(chǎn)生，類似的結(jié)果在雞的研究中也有報(bào)道[26]。谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(GSH-Px)是動(dòng)物體內(nèi)重要的抗氧化酶，能特異性地催化谷胱甘肽還原、清除機(jī)體內(nèi)有毒的過(guò)氧化物，保護(hù)生物膜和生物大分子免受氧化損傷[27]。試驗(yàn)結(jié)果顯示，飼料中添加膽汁酸組牛蛙肝臟GSH-Px的活力均顯著高于對(duì)照組，說(shuō)明膽汁酸能增強(qiáng)機(jī)體對(duì)抗活性氧的能力。郭永麗等[28]在草魚的研究中也有相似的結(jié)果。MDA是脂肪酸過(guò)氧化代謝產(chǎn)物，具有很強(qiáng)的生物毒性，是衡量肝臟受損傷程度的重要指標(biāo)[29]。在本試驗(yàn)中，飼料中添加200 mg/kg膽汁酸顯著降低了牛蛙肝臟MDA的含量，說(shuō)明飼料中添加適量膽汁酸能降低牛蛙肝臟脂質(zhì)過(guò)氧化作用，減輕生物毒性損傷。但結(jié)果表明，當(dāng)添加量達(dá)到300 mg/kg時(shí)，MDA含量急劇上升，可能是高劑量疏水性膽汁酸改變了黃嘌呤脫氫酶的分子構(gòu)象，暴露了氧化活化位點(diǎn)[30]，使自由基增加，也可能是膽汁酸對(duì)肝細(xì)胞的毒性作用，抑制了抗氧化酶(如SOD酶)活力，不利于自由基的清除，最終導(dǎo)致MDA增加，具體機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。由此可見(jiàn)，飼料中添加適宜量的膽汁酸能夠提高機(jī)體抗氧化酶能力，保護(hù)肝臟免受氧化損傷，而300 mg/kg以上的膽汁酸會(huì)加劇牛蛙肝臟氧化損傷。

3.4飼料中添加膽汁酸對(duì)牛蛙肝臟代謝酶的影響

谷草轉(zhuǎn)氨酶(GOT)和谷丙轉(zhuǎn)氨酶(GPT)是存在于細(xì)胞線粒體中的氨基轉(zhuǎn)移酶，在心肌細(xì)胞和肝臟中活力最高。GOT主要催化α-酮戊二酸與天冬氨酸轉(zhuǎn)氨基作用生成谷氨酸和草酰乙酸，而GPT主要在α-酮戊二酸和丙氨酸的轉(zhuǎn)氨基過(guò)程起作用[31]，其活力的高低反映肝臟對(duì)蛋白質(zhì)的代謝強(qiáng)度。在本研究中，隨著飼料膽汁酸添加量的升高，肝臟GOT活力表現(xiàn)出先升高再降低的趨勢(shì)，當(dāng)膽汁酸添加量為100 mg/kg時(shí)，GOT活力顯著高于對(duì)照組，說(shuō)明膽汁酸有利于提高肝細(xì)胞內(nèi)氨基酸的代謝能力，這與汪軍濤[26]的報(bào)道類似；而當(dāng)添加量為300 mg/kg時(shí)，我們發(fā)現(xiàn)GOT活力顯著降低，可能是鵝去氧膽酸對(duì)肝細(xì)胞線粒體產(chǎn)生了毒性[32]，而GOT是存在于線粒體內(nèi)的酶，因而其酶活力會(huì)受到鵝去氧膽酸的影響。肝臟不僅是氨基酸的代謝器官，也是機(jī)體進(jìn)行脂肪酸β代謝和調(diào)節(jié)脂肪蓄積的主要器官，其中LPL和HL是參與脂肪分解的關(guān)鍵酶。LPL主要催化乳糜微粒和極低密度脂蛋白中甘油三酯水解，對(duì)機(jī)體脂質(zhì)蓄積狀況產(chǎn)生決定性作用[33]。鄭珂珂等[34]發(fā)現(xiàn)，組織脂肪含量高能誘導(dǎo)LPL基因的表達(dá)，而本試驗(yàn)的結(jié)果也發(fā)現(xiàn)肝臟LPL活力與肝脂肪含量的變化趨勢(shì)具有很高的一致性。這說(shuō)明膽汁酸不是通過(guò)LPL和HL途徑降低牛蛙肝臟脂肪的沉積。由此可見(jiàn)，飼料中添加適量的膽汁酸可增強(qiáng)牛蛙肝臟氨基酸代謝能力和不依賴于酯酶的脂肪調(diào)節(jié)能力。

3.5飼料中添加膽汁酸對(duì)牛蛙肝臟外部形態(tài)的影響

目前，脂肪肝或者脂肪肝病在養(yǎng)殖魚類尚沒(méi)有獲得公認(rèn)的客觀標(biāo)準(zhǔn)[35]。在對(duì)人脂肪肝的診斷上，一般將肝臟粗脂肪含量(濕重)在5%-10%之間定性為輕度脂肪肝[36]。而動(dòng)物的肝臟脂肪含量與其種類、食性[37]、性別[38]和生長(zhǎng)階段[39]有關(guān)，因此，確立牛蛙脂肪肝和脂肪肝病的判斷標(biāo)準(zhǔn)，是將來(lái)需要開(kāi)展的研究。在本試驗(yàn)中，飼料中添加300 mg/kg的膽汁酸組牛蛙肝臟質(zhì)地偏硬，無(wú)彈性，表明肝臟可能有纖維化現(xiàn)象。已有研究表明，鵝去氧膽酸能間接激活表皮生長(zhǎng)因子受體(EGFR)而上調(diào)肝細(xì)胞中的早期生長(zhǎng)反應(yīng)基因-1(Egr-1)，而Egr-1能直接或間接作用增加肝細(xì)胞內(nèi)某些促炎介質(zhì)進(jìn)而誘導(dǎo)肝纖維化[40]。本研究中高劑量膽汁酸組牛蛙肝臟抗氧化酶活力降低，MDA含量顯著升高，說(shuō)明高劑量疏水性膽汁酸可能誘導(dǎo)肝臟線粒體產(chǎn)生過(guò)量的活性氧，也有報(bào)道認(rèn)為氧化應(yīng)激和細(xì)胞器功能失調(diào)是造成肝纖維化的另一個(gè)重要原因[35]，這些可能是攝食高劑量飼料膽汁酸的牛蛙肝臟變硬的原因。此外，有報(bào)道認(rèn)為疏水性膽汁酸可通過(guò)多種途徑誘導(dǎo)肝細(xì)胞損傷[27,41-42]，因此，高劑量的膽汁酸對(duì)牛蛙肝臟細(xì)胞的毒性機(jī)制尚有待進(jìn)一步研究。根據(jù)本試驗(yàn)的肝臟外部形態(tài)和生化指標(biāo)分析結(jié)果，飼料中添加300 mg/kg膽汁酸會(huì)引起牛蛙肝臟組織纖維化。

4結(jié)論

飼料中添加適量的膽汁酸能通過(guò)調(diào)節(jié)牛蛙肝臟脂類代謝水平和抗氧化能力以維護(hù)肝細(xì)胞的正常功能，降低牛蛙脂肪肝發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)。飼料中300 mg/kg的膽汁酸添加量對(duì)牛蛙肝臟組織有明顯的毒害作用。綜合本研究結(jié)果，建議飼料中膽汁酸添加量不超過(guò)200 mg/kg。

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