斑馬魚：線粒體與免疫系統(tǒng)的關(guān)系

摘要：線粒體是細胞器，通常與通過氧化磷酸化 (OXPHOS) 過程形成三磷酸腺苷 (ATP) 相關(guān)。然而，線粒體也負責鈣穩(wěn)態(tài)、凋亡、自噬和活性氧（ROS）的產(chǎn)生等功能，這些功能共同導致不同的細胞命運。線粒體形態(tài)的變化依賴于營養(yǎng)素的可用性和細胞的生物能量需求，這一過程稱為線粒體動力學，包括融合和分裂。這種細胞器感知微環(huán)境，并能將細胞修飾成促炎或抗炎狀態(tài)。斑馬魚越來越多地被用于研究線粒體動力學及其與免疫系統(tǒng)的聯(lián)系，因為參與這些過程的途徑和分子是相對保守的。目前有幾種基因工具和技術(shù)可用于分析斑馬魚線粒體。盡管斑馬魚呈現(xiàn)出哺乳動物已知的幾種類似過程，但在該模型中，線粒體在免疫系統(tǒng)中的作用尚未得到廣泛的研究。本文總結(jié)了斑馬魚線粒體功能和免疫代謝研究中的最新知識。

關(guān)鍵詞：線粒體  線粒體功能  新陳代謝  免疫學  免疫代謝  斑馬魚

簡介：線粒體被稱為“細胞的發(fā)電站”，因為其主要功能是通過三羧酸（TCA）循環(huán)中代謝產(chǎn)物的氧化產(chǎn)生能量，最終在電子傳遞鏈（ETC）中合成ATP。在這個過程中，丙酮酸或脂肪酸被丙酮酸脫氫酶（PDH）氧化為乙酰輔酶A，然后乙酰輔酶A與草酰乙酸形成檸檬酸。TCA 循環(huán)合成 FADH2 和 NADH，負責為 ETC 提供電子，ETC 反過來將這些電子轉(zhuǎn)移到分子氧，同時將質(zhì)子泵送穿過線粒體內(nèi)膜。這一過程產(chǎn)生了質(zhì)子驅(qū)動力，通過ATP合成酶復合物生成ATP。

線粒體代謝：細胞與線粒體之間的信號轉(zhuǎn)導機制有多種，如順行和逆行信號。逆行信號從線粒體到細胞質(zhì)，主要表現(xiàn)為線粒體活性氧（mtROS）的產(chǎn)生，包括過氧化物、超氧化物和羥基自由基等。ETC位于線粒體內(nèi)膜，具有四個電子傳遞復合物和ATP合成酶。它可以通過復合物I和III合成超氧化物，這些超氧化物可以進一步被超氧化物歧化酶（SOD）轉(zhuǎn)化為過氧化氫并釋放到細胞質(zhì)中，過氧化氫可以引起蛋白質(zhì)硫醇基團的氧化。一項有趣的研究調(diào)查了恒溫魚類和變溫魚類線粒體代謝功能之間的差異。由于恒溫魚類保持接近21°C的溫度，并不斷游泳呼吸，因此表明線粒體在補充肌肉收縮所消耗的ATP方面起著重要作用。因此，除了有氧代謝產(chǎn)生ATP外，還有活性氧的合成。另一方面，先前已經(jīng)表明，與大鼠的線粒體速率相比，變溫魚在分離的線粒體中具有較低的過氧化氫流出量。由于 ROS 的產(chǎn)生會加劇組織損傷，因此假設(shè)隨著魚類出現(xiàn)保溫現(xiàn)象，開發(fā)了一種補償機制來最大限度地減少這些影響。然而，與研究的變溫魚類相比，該研究沒有發(fā)現(xiàn)太平洋藍鰭金槍魚這種魚類的補償機制。在哺乳動物和魚類中同樣產(chǎn)生的線粒體ROS可調(diào)節(jié)缺氧誘導轉(zhuǎn)錄因子1（HIF-1）的激活，HIF-1在細胞適應(yīng)低氧水平方面起著重要作用。脊椎動物具有三種功能性 HIF-1α 異構(gòu)體：HIF-1α、HIF-2α 和 HIF-3α。HIF-1 由兩個亞基組成，氧調(diào)節(jié)亞基 (HIF-1α) 和組成型表達亞基 (HIF-1β)。HIF-1α 在代謝、線粒體功能、炎癥細胞募集等生理表型中的作用已被定義。在斑馬魚和其他硬骨魚中，由于進化過程中的全基因組重復事件，每個 HIF-α 異構(gòu)體都有兩個拷貝。一項調(diào)查 hif1aa 和 hif1ab 對線粒體調(diào)節(jié)作用的研究表明，這兩種旁系同源物都提供不同的功能：hif1aa負責調(diào)節(jié)Ca2+濃度、ROS產(chǎn)生、檸檬酸合成酶的轉(zhuǎn)錄水平以及線粒體膜電位的增加，而hif1ab通過增加復合物I、III和IV的活性以及促進ATP生成來促進OXPHOS。此外，hif1aa和hif1ab都促進線粒體生成。線粒體的其他逆行信號功能包括通過改變 TCA 循環(huán)中間體（如琥珀酸、乙酰輔酶 A、α-酮戊二酸和富馬酸）的可用性來影響信號通路。另一方面，線粒體可以通過從細胞質(zhì)到線粒體的順行信號與細胞通信。可以看到響應(yīng)于細胞質(zhì)高鈣水平的順行信號，這導致鈣快速整合到線粒體基質(zhì)中。鈣的流入可以調(diào)節(jié) OXPHOS 并通過激活來自 TCA 循環(huán)的脫氫酶來影響耗氧量和 ATP 的形成。這也導致線粒體一氧化氮合酶 (mtNOS) 產(chǎn)生一氧化氮，該酶通過對細胞色素氧化酶的競爭性抑制來調(diào)節(jié)耗氧率。這種負反饋機制允許氧氣向細胞的其余部分流動。另一項研究表明，鈣內(nèi)流增加了復合物 I、III、IV 的電導、ATP 生產(chǎn)/運輸在骨骼肌細胞中的作用，進一步支持 Ca2+ 激活該途徑的觀點。有一些關(guān)于斑馬魚毛細胞鈣吸收和鈣內(nèi)流的研究。眾所周知，Ca2+ 是一種重要元素，尤其是對脊椎動物而言。 在陸生脊椎動物的情況下，這種元素的主要來源是食物，腸道是其吸收的主要場所。顯然，水生動物的環(huán)境容易受到水中不同濃度Ca2+的影響。因此，鰓成為魚類吸收Ca2+的主要場所。然而，在魚類早期胚胎和仔魚中，鈣的吸收主要通過富含線粒體的皮膚細胞。

線粒體與斑馬魚免疫系統(tǒng)：斑馬魚免疫系統(tǒng)顯示出不同的時間激活，，其中先天免疫系統(tǒng)在受精后48小時（HPF）處于激活狀態(tài)，而適應(yīng)性免疫系統(tǒng)在受精后4-6周（wpf）左右完全成熟。斑馬魚和人類細胞的成熟不同：哺乳動物造血干細胞 (HSC) 在卵黃囊中發(fā)育，然后在骨髓中發(fā)育，而斑馬魚HSC 在背主動脈的腹側(cè)內(nèi)皮細胞上發(fā)育，然后遷移到后主靜脈，移動到尾側(cè)造血組織 (CHT)，大約 48 hpf開始增殖。然后HSC從 CHT 移動到前腎和胸腺，到受精后第六天（dpf），造血干細胞遷移到其最終和確定位置：腎骨髓。適應(yīng)性免疫系統(tǒng)的發(fā)育在 3 dpf 左右開始，具有 V(D)J rag1-2 依賴性機制，但T細胞和B細胞在受精后4-6周 (WPF) 被激活和循環(huán)。此外，斑馬魚 B 細胞不進行類別轉(zhuǎn)換，僅表達 IgM、IgD 和 IgZ/T 亞型。第一個先天免疫細胞和第一個適應(yīng)性免疫細胞出現(xiàn)之間的時間距離允許對斑馬魚免疫系統(tǒng)進行劃分。

免疫系統(tǒng)由一系列特化細胞類型組成，這些細胞類型可以響應(yīng)來自病原體和宿主本身的各種危險信號，以維持體內(nèi)平衡。同樣，這些細胞的新陳代謝也需要適應(yīng)，響應(yīng)底物的可用性和每個細胞不斷變化的代謝需求，以執(zhí)行其效應(yīng)功能。在炎癥和感染環(huán)境中先天性免疫細胞，特別是巨噬細胞和中性粒細胞的細胞代謝對特定組織的功能已被廣泛研究。巨噬細胞是高度可塑性的細胞，由大量異質(zhì)性細胞組成。它們的主要功能是識別與損傷及病原體（分別為DAMPs和PAMPs）相關(guān)的分子模式，通過合成活性氧和吞噬機制清除病原體，清除細胞碎片和產(chǎn)生細胞因子。在斑馬魚感染的情況下，線粒體 ROS 的產(chǎn)生是必不可少的，海洋分枝桿菌感染的情況下，巨噬細胞 ROS 的產(chǎn)生增加。因此，一旦被 TNF-α 誘導，就會激活壞死途徑。從這個意義上說，mtROS 的產(chǎn)生可以通過 MitoTracker Red CM-H2Xros 進行評估，因為氧化后的線粒體會發(fā)出紅色熒光。此外，它們可以促進作用于組織重塑的分子的合成，從而導致組織再生、修復或纖維化。激活后，這些細胞可能表現(xiàn)出不同的形態(tài)，這取決于它們所處的微環(huán)境。在體外模型中，當受到IFN-γ或脂多糖（LPS）刺激時，M0巨噬細胞極化為促炎性巨噬細胞（也稱為M1）或典型激活，而當受到細胞因子（如IL-4或IL-13）刺激時，巨噬細胞轉(zhuǎn)化為抗炎或促分解表型（M2）。此外，巨噬細胞極化可以通過細胞內(nèi)信號、可溶性蛋白和轉(zhuǎn)錄因子進行調(diào)節(jié)，例如當 Toll 樣受體信號激活信號轉(zhuǎn)導和轉(zhuǎn)錄激活因子 (STAT) 1 蛋白時，可導致巨噬細胞向M1樣表型發(fā)展。盡管這是一個有點過于簡單的命名法，但它是研究代謝和其他生物過程的一種手段，并將其與這些細胞的表型特征相關(guān)聯(lián)。這種極化過程在硬骨魚中也有描述，其特征是誘導型一氧化氮合酶（iNOS）和精氨酸酶2（Arg2）分別作為M1和M2樣細胞的標記。有趣的是，已經(jīng)進行了體外研究，哺乳動物LPS受體TLR4可能在這些魚類中不起作用。由于這種微生物刺激物被認為是一種重要的免疫刺激物，因此可以通過不同的機制感知LPS。重要的是，哺乳動物保留單個IFN-γ分子，這些分子對極化為M1巨噬細胞很重要。相比之下，許多硬骨魚表現(xiàn)出多種IFN-γ，它們具有不同的作用，一些誘導產(chǎn)生嚴格意義上的ROS，但不產(chǎn)生一氧化氮（NO），而另一些誘導產(chǎn)生NO和有限的 ROS。促炎巨噬細胞使用糖酵解、戊糖-磷酸途徑 (PPP) 和脂肪酸合成進行代謝程序。與M0細胞相比，M1巨噬細胞的耗氧量減少，表明其對線粒體代謝的依賴性較小，ATP的合成主要通過糖酵解進行。與此相反，抗炎巨噬細胞除了FAO、谷氨酰胺分解和色氨酸分解代謝外，還具有增強的氧磷代謝。

斑馬魚線粒體代謝與免疫系統(tǒng)的關(guān)系：線粒體代謝過程與炎癥反應(yīng)和組織損傷有關(guān)。組織損傷后，炎癥反應(yīng)被觸發(fā)，血液白細胞通過內(nèi)皮細胞進入損傷區(qū)域。首先參與炎癥反應(yīng)的細胞是中性粒細胞，其次是巨噬細胞，它們具有通過胞吐作用清除周圍碎屑的功能。線粒體中的生物過程參與吞噬作用，特別是通過線粒體膜蛋白（UCP）去耦蛋白2的參與。Park及其合作者的一項研究表明，Ucp2的缺失降低了小鼠巨噬細胞的吞噬能力，Ucp2表達的增加與巨噬細胞吞噬能力的增加有關(guān)。硬骨魚鯽魚在酵母聚糖試驗種表現(xiàn)出獨特的反應(yīng)。穩(wěn)態(tài)期間循環(huán)白細胞的總分數(shù)中含有<5%的中性粒細胞，但當該動物模型受到應(yīng)激時，中性粒細胞占50%。在這項研究中，在注射后18和48小時分離中性粒細胞，時間點分別相當于促炎癥和促分解階段。有趣的是，這些細胞表現(xiàn)出不同的表型，促炎癥階段細胞釋放白三烯B4并促進巨噬細胞ROS的產(chǎn)生。相比之下，在促分解階段細胞產(chǎn)生低水平的 ROS，釋放脂氧素 A4，這是一種促分解脂質(zhì)介質(zhì)，有助于巨噬細胞攝取凋亡細胞。由 Drp1 蛋白介導的線粒體裂變在胞吞作用過程中也是必需的。 Drp1 誘導內(nèi)質(zhì)網(wǎng)釋放鈣，這是巨噬細胞形成吞噬體和消除凋亡細胞所必需的過程。因此，線粒體裂變使巨噬細胞能夠消除幾個凋亡小體，并避免不消除這些凋亡殘留物的病理后果。 胞吞作用失敗可導致重要疾病，如自身免疫性疾病和動脈粥樣硬化。

通過硬骨魚研究評估了 M1 和 M2 巨噬細胞在基礎(chǔ)和應(yīng)激條件下的代謝。通過實時測量耗氧量和乳酸酸化，發(fā)現(xiàn)M1巨噬細胞除了改變糖酵解途徑外，還增加了一氧化氮的合成和免疫反應(yīng)基因1（irg1）的表達。在 M2 巨噬細胞中，精氨酸酶活性增加，糖酵解和 OXPHOS 途徑與對照組相似。結(jié)果表明代謝變化與不同的巨噬細胞表型有關(guān)，類似于哺乳動物。涉及斑馬魚 irg1 的研究揭示了感染期間免疫細胞的葡萄糖和脂質(zhì)代謝的變化。在對鼠傷寒沙門氏菌感染的反應(yīng)中，巨噬細胞表現(xiàn)出irg1的表達增加，irg1是一種線粒體相關(guān)酶，可誘導脂肪酸分解代謝以維持OXPHOS，從而產(chǎn)生mtROS。有助于在吞噬過程中殺死細菌，表明該酶是免疫代謝軸的關(guān)鍵組成部分，與感染、細胞代謝和巨噬細胞效應(yīng)功能相關(guān)。在斑馬魚肺結(jié)核模型中，過量的 TNF 誘導受感染巨噬細胞中 mtROS 的形成，增加其殺微生物活性，但也誘導壞死，使分枝桿菌釋放到細胞外介質(zhì)中。該途徑由線粒體親環(huán)蛋白 D 和酸性鞘磷脂酶介導的神經(jīng)酰胺產(chǎn)生激活。 當這條通路被化學抑制時，效果就會逆轉(zhuǎn)。這暴露了斑馬魚在線粒體相關(guān)條件下進行治療性化合物測試的潛力。線粒體是細胞凋亡和炎癥的信號中心，導致以 ETC 副產(chǎn)物形式產(chǎn)生 mtROS，進而對細胞信號通路產(chǎn)生顯著影響。Peterman 等人證明了抗氧化酶 SOD2 在調(diào)節(jié)斑馬魚仔魚 mtROS 中的作用。響應(yīng)銅綠假單胞菌的感染，sod2 缺陷斑馬魚表現(xiàn)出更大的細菌負荷，增加死亡率，并減少吞噬細胞的數(shù)量，表明 sod2 通過保護巨噬細胞和中性粒細胞免受超氧化物線粒體的負面影響來增加先天免疫功能。關(guān)于線粒體代謝在免疫系統(tǒng)細胞性能中的作用仍有很多需要評估。像斑馬魚這樣的活體模型可以成為這一領(lǐng)域的有力工具，為生理和病理背景下線粒體功能的研究提供答案。

結(jié)論：斑馬魚的線粒體功能也與免疫功能有關(guān)，與巨噬細胞有關(guān)。與哺乳動物類似，斑馬魚的巨噬細胞在一氧化氮合成、糖酵解和 OXPHOS 途徑中具有不同的代謝設(shè)置，增加了 mtROS 的產(chǎn)生以應(yīng)對感染。mtROS 的產(chǎn)生與抗氧化酶 SOD2 相關(guān)，而 SOD1 與中性粒細胞運動相關(guān)。根據(jù)目標了解每種模型和技術(shù)組合的優(yōu)缺點非常重要。這些工具的開發(fā)和改進將幫助研究人員改進斑馬魚線粒體研究，并為分析線粒體功能障礙和疾病創(chuàng)造新的選擇。