斑馬魚早期卵子發(fā)生的分析方法

摘要：

卵母細(xì)胞分化是一個(gè)高度動(dòng)態(tài)和復(fù)雜的發(fā)育過程，其機(jī)制理解促進(jìn)了女性生殖、生育和卵巢癌生物學(xué)。盡管斑馬魚模型具有許多特性，但它尚未完全用于研究早期卵母細(xì)胞分化和卵巢發(fā)育。部分原因是成年斑馬魚卵巢的特性使得獲取早期卵母細(xì)胞在技術(shù)上具有挑戰(zhàn)性。為了克服這些技術(shù)障礙，我們利用了斑馬魚幼魚的卵巢，在那里早期卵母細(xì)胞可以容易地大量發(fā)現(xiàn)并以可預(yù)測(cè)的方式進(jìn)展。我們對(duì)卵母細(xì)胞分化和卵巢發(fā)育的早期階段進(jìn)行了描述，并確定了準(zhǔn)確的分期標(biāo)準(zhǔn)。我們進(jìn)一步發(fā)展了定量顯微鏡、實(shí)時(shí)成像技術(shù)、卵巢培養(yǎng)和卵母細(xì)胞的階段性分離用于生化分析。這些方法最近為我們提供了關(guān)于早期卵子發(fā)生的史無前例的觀點(diǎn)，使我們能夠研究Balbiani體的形成，盡管Bb具有巨大的發(fā)展意義，但是它很少被研究，并且它是如何形成的，兩個(gè)多世紀(jì)以來在任何物種中都是未知的。我們能夠追蹤Balbiani體的形成和卵母細(xì)胞對(duì)稱性斷裂到減數(shù)分裂的開始。本研究揭示了卵母細(xì)胞新的細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)，以及特化的細(xì)胞組織對(duì)分化的貢獻(xiàn)。總的來說，幼年斑馬魚卵巢是細(xì)胞和發(fā)育生物學(xué)研究的一個(gè)令人興奮的模型。我們描述了斑馬魚身上開發(fā)的卵巢研究的方案，包括所有實(shí)驗(yàn)步驟，這些步驟將允許其他斑馬魚重復(fù)這種分析。

簡介：

雖然早期卵子發(fā)生已經(jīng)在果蠅中被廣泛地描述，但是其卵子發(fā)生和卵巢發(fā)育的模式并不代表脊椎動(dòng)物，盡管有些方面是保守的。在小鼠中，對(duì)卵子發(fā)生的一般進(jìn)展進(jìn)行了表征，并研究了許多破壞卵子發(fā)生的突變基因。斑馬魚尚未完全用于卵子發(fā)生的研究，部分原因是缺乏分子和形態(tài)學(xué)特征以及缺乏足夠的分析工具。三維（3D）高分辨率細(xì)胞視圖是發(fā)育過程的形態(tài)學(xué)和細(xì)胞分化特征全面分析的關(guān)鍵。成年斑馬魚卵巢對(duì)早期卵母細(xì)胞的這種分析提出了挑戰(zhàn)，早期卵母細(xì)胞非常小。成年斑馬魚卵巢形態(tài)學(xué)上厚而呈小葉狀，含有多期卵母細(xì)胞的非同步混合。許多是晚期卵母細(xì)胞，非常大（直徑為200～730μm），不透明。早期卵母細(xì)胞非常小（8～30μm），透明。這為早期卵母細(xì)胞的分析提供了技術(shù)上的障礙。首先，小而透明的早期卵母細(xì)胞在大的不透明卵母細(xì)胞中很難識(shí)別。其次，成年斑馬魚卵巢的厚度使得獲得抗體和生命染料的均勻穿透具有挑戰(zhàn)性，這是高分辨率定量成像所必需的。第三，厚的卵巢也降低了共焦顯微鏡圖像采集的質(zhì)量。因此，斑馬魚早期的卵子發(fā)生很少被整個(gè)高級(jí)顯微鏡所接近，并且主要通過組織切片的分析來解決，而組織切片缺乏3D信息。由于這些限制，對(duì)早期卵子發(fā)生過程中卵母細(xì)胞發(fā)育的描述和機(jī)理理解一直缺乏。為了規(guī)避這些問題，我們和其他人已經(jīng)使用幼年卵巢作為早期卵子發(fā)生的模型。與成人卵巢相比，幼年卵巢扁平且伸長。它只包含年輕的發(fā)育透明的卵母細(xì)胞。在給定的青春期卵巢中的卵母細(xì)胞一般處于每周進(jìn)展的類似階段。這為染色和共聚焦成像技術(shù)提供了極好的條件，在共聚焦成像技術(shù)中，容易發(fā)現(xiàn)大量所需階段的卵母細(xì)胞。我們利用了幼年卵巢的這些特性，建立了定量顯微鏡和活體延時(shí)成像的方法，提供了卵子發(fā)生過程的極好視圖。我們已經(jīng)確定了早期卵母細(xì)胞的精確分期標(biāo)準(zhǔn)。我們還開發(fā)了短期的卵巢培養(yǎng)方案。

我們開發(fā)了一種分離特定卵母細(xì)胞的方法進(jìn)行生化分析。這個(gè)工具箱又可以應(yīng)用于卵子發(fā)生的功能喪失的遺傳研究。因此，斑馬魚幼體卵巢作為研究早期脊椎動(dòng)物卵子發(fā)生的模型具有很大的優(yōu)勢(shì)。我們描述了受精后4-10周幼年卵巢的發(fā)育過程。魚類設(shè)施之間的環(huán)境條件不同，例如喂養(yǎng)方式，導(dǎo)致幼魚生長速度不同。此外，在一致的條件下，在同一水箱中飼養(yǎng)的個(gè)體之間的生長可能有所不同。更精確的胚胎后發(fā)育的標(biāo)準(zhǔn)化測(cè)量被確定為標(biāo)準(zhǔn)長度(SL；從鼻子到尾巴底部的長度以毫米為單位，不包括尾鰭)。我們監(jiān)測(cè)了實(shí)驗(yàn)室在4和10 WPF之間飼養(yǎng)的魚類SL。在4 WPF 72%的魚中（n＝32）SL＝8～11 mm，28% SL＝6～8毫米。在5—6WPF， 92%的魚（n＝143）SL＝10～14 mm，8%在15毫米以上。我們發(fā)現(xiàn)，SL=8-10mm的魚卵巢在減數(shù)分裂開始時(shí)主要含有生殖系干細(xì)胞、卵原細(xì)胞和卵母細(xì)胞。魚卵巢SL=10～20mm，早期雙線期I期卵母細(xì)胞直徑≤60μm。這些發(fā)現(xiàn)與以前的報(bào)告是一致的。因此，可以選擇特定SL范圍的卵巢來分析感興趣的卵母細(xì)胞階段。為了確定幼年卵巢的早期卵子發(fā)生階段是否反映了成年卵巢的卵子發(fā)生，我們對(duì)成年卵巢的早期卵母細(xì)胞階段進(jìn)行了分析。我們解剖成人卵巢，手動(dòng)去除所有大的不透明卵母細(xì)胞（III和IV期，卵母細(xì)胞形成期），并分析含有年輕卵母細(xì)胞的卵巢組織塊（I和II期）。

我們證實(shí)，早期卵子發(fā)生的主要形態(tài)特征，如卵母細(xì)胞的階段和大小、核的形狀、染色體凝聚、核仁的數(shù)目和位置、Balbiani體形成和一般細(xì)胞組織(以下均描述)在幼蟲和成蟲卵子之間是一致的。除了有利的物理特性外，幼年卵巢還提供更強(qiáng)有力的統(tǒng)計(jì)分析。在斑馬魚中，所有魚類的未成熟性腺最初發(fā)育為卵巢。這種性腺具有雙潛能，以后或者進(jìn)一步發(fā)展為卵巢，或者轉(zhuǎn)變?yōu)椴G丸。性別決定的過程決定了性腺的命運(yùn)，要么繼續(xù)發(fā)展為卵巢，要么轉(zhuǎn)變?yōu)椴G丸。實(shí)驗(yàn)室菌株的性別決定依賴于環(huán)境線索，目前尚不完全清楚，但睪丸的轉(zhuǎn)變機(jī)制部分已知。在這個(gè)過程中，凋亡導(dǎo)致卵母細(xì)胞的丟失。當(dāng)信號(hào)未知時(shí)，卵母細(xì)胞可能向體卵泡細(xì)胞發(fā)出信號(hào)以表達(dá)cyp19a1a，一種將睪酮轉(zhuǎn)化為雌激素的芳香化酶，并下調(diào)抗苗管激素(amh)的表達(dá)。卵母細(xì)胞丟失導(dǎo)致CYP19A1A表達(dá)下調(diào)并誘導(dǎo)AMH的表達(dá)，AMH誘導(dǎo)精子發(fā)生，性腺發(fā)育為睪丸。卵母細(xì)胞凋亡的初始信號(hào)尚不清楚。在性別確定之前使用卵巢的優(yōu)點(diǎn)是，所有個(gè)體最初都作為雌性發(fā)育，允許實(shí)驗(yàn)有更大的樣本量。避免幼年卵巢向睪丸轉(zhuǎn)變是很重要的，因?yàn)樗鼈兒胁环从痴Ｂ炎影l(fā)生進(jìn)程的凋亡卵母細(xì)胞。我們發(fā)現(xiàn)，在SL<15mm的魚中，這種轉(zhuǎn)換卵巢是罕見的（~10%，n>33），在SL=15-21mm的魚中，這種轉(zhuǎn)換卵巢的頻率逐漸增加，這與先前的報(bào)道一致。因此，我們使用SL＜15毫米的魚類卵巢。轉(zhuǎn)變?yōu)椴G丸的卵巢在形態(tài)上是不同的，而且在解剖過程中易于識(shí)別，因?yàn)樗鼈冊(cè)谛螒B(tài)上更類似于睪丸，更薄，更不透明，并且具有更少的清晰可見的卵母細(xì)胞。此外，在共聚焦顯微鏡分析中，過渡到睪丸的性腺很少有稀疏分離的卵母細(xì)胞，并且含有較松散的組織。變性的凋亡細(xì)胞核也明顯且易于通過DAPI染色檢測(cè)為比正常細(xì)胞核更小更亮的非晶斑點(diǎn)。在SL<15mm的魚性腺出現(xiàn)凋亡或轉(zhuǎn)變的跡象之前，性別決定過程可能開始。此外，我們對(duì)早期卵母細(xì)胞階段的觀察在幼年卵巢和成年卵巢之間是一致的，這表明它們反映了正常的卵子發(fā)生，正如其他人所報(bào)道的。因此，如果這些過程發(fā)生，它們很可能不會(huì)在轉(zhuǎn)變?yōu)椴G丸之前影響早期卵子發(fā)生。總之，斑馬魚幼魚卵巢作為一個(gè)令人興奮的遺傳模型，用于研究卵巢的細(xì)胞和發(fā)育生物學(xué)、生殖細(xì)胞發(fā)育、生殖和器官發(fā)生。此外，雖然斑馬魚作為胚胎和幼體發(fā)育的模型被廣泛研究，但是斑馬魚幼體后發(fā)育的研究范圍要小得多。

方法：

卵母細(xì)胞分期標(biāo)準(zhǔn);根據(jù)超微結(jié)構(gòu)分析，斑馬魚卵子發(fā)生已分為四個(gè)主要階段。第一階段（卵母細(xì)胞直徑7-140 um）跨越從減數(shù)分裂開始到減數(shù)分裂前期的細(xì)長和停滯的卵母細(xì)胞發(fā)育的早期階段，卵母細(xì)胞在大小上顯著增加。在II期（卵母細(xì)胞直徑為140-340m），卵黃包膜開始形成，皮層顆粒在卵子激活后產(chǎn)生，在改變卵黃包膜的皮層反應(yīng)中產(chǎn)生胞吐。III期（直徑340-690m）卵母細(xì)胞被稱為卵黃形成期，此時(shí)卵黃形成蛋白（蛋黃）積累。卵母細(xì)胞然后在IV期(直徑690-730m)恢復(fù)并完成減數(shù)分裂I，稱為卵母細(xì)胞成熟，一旦排卵就變成完全成熟的卵子（直徑730-750 m）。從I到IV的所有階段通常在成年卵巢中發(fā)現(xiàn)。卵子發(fā)生的第一階段跨越減數(shù)分裂和卵母細(xì)胞分化的許多關(guān)鍵事件，如染色體配對(duì)和重組、卵母細(xì)胞極化和Balbiani體形成，以及單個(gè)卵母細(xì)胞從囊腫到卵泡的細(xì)胞組織變化。根據(jù)卵母細(xì)胞的卵泡生成狀態(tài)，I期以前被分為IA期和IB期；在它們周圍有卵泡細(xì)胞的單個(gè)卵母細(xì)胞被稱為IB期，而之前的所有階段被稱為IA期。減數(shù)分裂的幾個(gè)關(guān)鍵事件發(fā)生在IA期，這些事件先前被進(jìn)一步用形態(tài)學(xué)標(biāo)準(zhǔn)表征。這些減數(shù)分裂亞期的一個(gè)更明確的標(biāo)記是端粒分布動(dòng)力學(xué)。在減數(shù)分裂（瘦素階段）開始時(shí)，端粒被裝載在核膜（NE）上，它們?cè)贜E上的旋轉(zhuǎn)促進(jìn)染色體同源性搜索。端粒然后聚集到NE的一個(gè)極點(diǎn)（合子期，花束形成），最終穩(wěn)定配對(duì)。在花束之后，發(fā)生同源重組（粗線期），端粒在NE上徑向分散，并卸載回細(xì)胞核。

我們利用端粒動(dòng)力學(xué)、核形態(tài)學(xué)標(biāo)準(zhǔn)和卵母細(xì)胞大小建立了精確的分期標(biāo)準(zhǔn)，以區(qū)分卵子發(fā)生的第一階段中的關(guān)鍵事件，具體地識(shí)別減數(shù)分裂的進(jìn)展步驟。完整的卵母細(xì)胞的分析允許更精確的測(cè)量卵母細(xì)胞大小。由于卵母細(xì)胞在卵巢中通常不是完美的球體，因此很難測(cè)量和計(jì)算它們的絕對(duì)大小。作為卵母細(xì)胞大小的指示，我們定義了近似的卵母細(xì)胞直徑。這個(gè)直徑是通過使用具有最大尺寸的Z截面測(cè)量跨越卵母細(xì)胞最寬直徑的兩條垂直線（或接近垂直線）而產(chǎn)生的。這兩條線的平均值是卵母細(xì)胞的大致直徑。我們發(fā)現(xiàn)卵母細(xì)胞可以在不同的卵巢中進(jìn)行一致的分期。我們對(duì)生殖系卵囊和卵巢中卵母細(xì)胞的組織及其單個(gè)卵泡的形成進(jìn)行了鑒定，每個(gè)卵泡的形成都與固有的減數(shù)分裂階段相一致。

方法：

1、在冷水中對(duì)斑馬魚進(jìn)行安樂死。

2、把魚放在解剖盤上，在解剖顯微鏡下測(cè)量它的SL。SL=10-15mm是理想的。在這個(gè)范圍較小的魚有年輕的I期卵母細(xì)胞，而在這個(gè)范圍較大的魚有逐漸晚的I期卵母細(xì)胞。

3用一根針穿過眼睛，另一根通過尾部的底部把魚釘在盤子上。

4、在解剖顯微鏡下進(jìn)行如下切割：沿著腹部中線從泄殖腔解剖到鰓。從泄殖腔背部切割。從前尖到背側(cè)切割。這些切口造成身體壁和肌肉組織的翻轉(zhuǎn)。抬起這個(gè)皮瓣，沿著前后軸在其背側(cè)邊緣切開，以便完全切除。

5、切斷魚的頭部和尾部并丟棄。將包括暴露的內(nèi)臟器官的主干轉(zhuǎn)移到冷的4%多聚甲醛（PFA）中。一個(gè)含PFA的15毫升錐形管可以放置15至20個(gè)。

6、在4°C固定過夜。

7、將碎片和PFA倒入冰面上的大塑料盤中，用移液管移除PFA，加入1xPBS。

8、在1xPBS中沖洗固定組織2次（2X）。

9、用新鮮1xPBS將主干移到玻璃培養(yǎng)皿中.

10、用鑷子將卵巢精細(xì)解剖。

11、在解剖顯微鏡下摘除肝臟、消化系統(tǒng)和鰾。

12、找到兩個(gè)卵巢，并在前端和后端切斷與身體其他部位的連接點(diǎn)。沿著前后軸輕輕地拉出卵巢，但不直接接觸卵巢，而是將脂質(zhì)組織固定在卵巢周圍，使其遠(yuǎn)離身體。在制備用于固定的主干片期間，一個(gè)卵巢可能粘附在被移除的體壁上并且丟失。其他卵巢仍可收集。

13、輕輕地把卵巢放在盤子底部。分離兩個(gè)卵巢，在它們的后尖，其合并到輸卵管中，切下。輕輕地從結(jié)締組織和脂質(zhì)細(xì)胞包圍中清潔卵巢。避免在牽拉時(shí)直接接觸卵巢，并通過脂質(zhì)組織保持。卵巢越清潔，抗體穿透和成像越好。

14、將所有解剖卵巢放入新鮮的X1-PBS冰上的玻璃9孔板中。每個(gè)人可以根據(jù)大小選擇10至16個(gè)卵巢。

15、匯集每個(gè)基因型的所有解剖卵巢有助于以后根據(jù)卵巢數(shù)量更有效地設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)，在實(shí)驗(yàn)組或儲(chǔ)存條件（PBS或MeOH）之間劃分卵巢。即使在類似SL的魚中，卵巢大小也有一定的變異性。匯集卵巢有助于在實(shí)驗(yàn)組之間更均勻地分布卵巢，從而獲得更可重復(fù)的結(jié)果。

評(píng)論：

如前所述，在取出體壁瓣時(shí)，靠近體壁的卵巢保持附著在體壁上的時(shí)間為10～20％，因此可用體壁去除。如果從所有魚類都需要雙側(cè)卵巢的珍貴基因型中解剖卵巢，則跳過切割2至5，進(jìn)入步驟5。然后在固定后解剖兩個(gè)卵巢。一旦卵巢從魚體內(nèi)被解剖出來，直到所有的脂肪細(xì)胞被去除，它們就會(huì)漂浮，并且可能會(huì)丟失。輕輕地握住卵巢，用一只鉗子把它們放在盤子底部，同時(shí)用另一只鉗子進(jìn)行解剖。在分離兩個(gè)卵巢之前移除一些脂肪細(xì)胞，以防止未處理的卵巢浮起.為了轉(zhuǎn)移解剖卵巢，使用寬玻璃巴斯德吸管。燒灼吸液管的邊緣，使其光滑，防止其破裂卵巢。鉗子也可以輕輕使用。除使用微管穩(wěn)定緩沖液（MSB）時(shí)微管染色外，然后使用37%甲醛在1XMSB中制備4%甲醛。MSB為酸性，與PFA不相容。10xPBS的pH值是7.4。

活體卵母細(xì)胞/卵巢的時(shí)間推移成像：卵母細(xì)胞的實(shí)時(shí)成像是高時(shí)間分辨率分析和更全面了解動(dòng)態(tài)生物學(xué)過程的關(guān)鍵。許多高度動(dòng)態(tài)的事件是早期卵母細(xì)胞分化和極化的基礎(chǔ)，如卵原細(xì)胞的有絲分裂、瘦素向粗線期減數(shù)分裂卵母細(xì)胞的染色體和端粒動(dòng)力學(xué)，以及粗線期到早期二線期核裂隙的形成。我們利用熒光標(biāo)記的轉(zhuǎn)基因和熒光活性染料建立了斑馬魚幼魚卵巢的分離、培養(yǎng)和活體延時(shí)成像方案。

方法：

1、用0.02%丁卡因麻醉魚。

2、將魚放在解剖盤上，測(cè)量其SL。SL＝10—20毫米是理想的。較小的魚會(huì)擁有較年輕的卵母細(xì)胞，較大魚卵母細(xì)胞發(fā)育較晚。

3、使魚安樂死。通過尾巴底部將魚釘在盤子上，并用鑷子將前端向下夾住。去除頭和尾。

4、把包括暴露的內(nèi)臟器官的主干片放入一個(gè)玻璃盤中，Hank's溫度升至28℃。去除消化系統(tǒng)。找到兩個(gè)卵巢，并在前端和后端切斷與身體其他部位的連接點(diǎn)。沿著前后軸輕輕地拉出卵巢，但不直接接觸卵巢，而是將脂質(zhì)組織固定在卵巢周圍，使其遠(yuǎn)離身體。輕輕地把卵巢放在盤子底部。分離兩個(gè)卵巢，在它們的后尖，其合并到輸卵管中，切下。輕輕地從結(jié)締組織和脂質(zhì)細(xì)胞包圍中清潔卵巢。避免在牽拉時(shí)直接接觸卵巢，并通過脂質(zhì)組織保持。卵巢越清潔，抗體穿透和成像越好。將所有剖開的卵巢放入玻璃孔板中，新鮮的HL-15加熱至28℃。保持活卵巢在28°C是至關(guān)重要的。在每個(gè)卵巢的解剖過程中，保持在28°C。如果對(duì)轉(zhuǎn)基因進(jìn)行成像，用熒光解剖鏡檢查卵巢是否為陽性信號(hào)。這不能提供細(xì)胞內(nèi)的分辨率，但能分辨出陰性或微弱的信號(hào)卵巢，并省去不必要的額外處理。卵巢在28°C下放置30分鐘。

結(jié)論：

雖然斑馬魚尚未被充分開發(fā)用于卵子發(fā)生的研究，但它提供了幾個(gè)極好的模型，包括全套卵巢的實(shí)時(shí)推移高分辨率成像，以及易于接近卵巢，在脊椎動(dòng)物sp中具有強(qiáng)大的統(tǒng)計(jì)分析能力。