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金魚（Carassius auratus）屬鯉形目（Cypriniformes），鯉科（Cyprinidae），鯽屬（Carassius），原產于中國，是野生鯽經人工選擇發(fā)生快速演化而來的彩色變種，成為研究魚類形態(tài)進化的優(yōu)良模型。同鯉一樣，金魚經歷了除硬骨魚類特有的第三輪全基因組復制（Teleost-specific WGD）之外的第四輪全基因組復制事件，因此也是研究硬骨魚類基因組倍性演化的良好材料。
鯽（左）及其變種金魚（右），圖片來自FIMSEA & Aquatic Log
01
基因組組裝、注釋及演化時間推演
該版本基因組采用71X PacBio單分子實時(Single Molecule, Real-Time, SMRT)測序技術對一尾雌核發(fā)育的和金金魚（Wakin goldfish）進行全基因組測序，并結合已發(fā)表的金魚遺傳連鎖圖譜將基因組組裝至50條染色體，總長度為1246 Mbp。
為了輔助基因組注釋，研究者對金魚的腦、鰓、眼睛等7個組織進行轉錄組測序，共獲得70324個蛋白編碼基因，其中24026個是與斑馬魚、草魚或鯉共有的（圖1C）。此外，研究者還通過70X Illumina短讀長測序檢測了金魚基因組的核苷酸變異信息，在此不再贅述。
利用得到的基因組遺傳變異信息，基于同源基因對（orthologous/ohnologous gene pairs）進行了非同義替換（synonymous substitution, dS）分析，結果顯示WGD發(fā)生于金魚和鯉分化之前（圖1D）。以20.5 Mya（百萬年前）作為草魚和鯉的分化時間，結合繪制的物種分化樹推算出第四輪全基因組復制事件發(fā)生于約14.4 Mya，而金魚和鯉的物種形成時間在大約11.0 Mya（圖1E）。
圖1. 測序信息及金魚（GF）、草魚（GC）、鯉（CC）和斑馬魚（ZF）基因組的進化分析
（A：用于三代測序的雌核發(fā)育和金金魚，B：金魚、斑馬魚基因組重復元件，C：基因分布，D：同義替換率，E：物種進化關系）
02
WGD后廣泛保留的共線性
理論上，分化時間越短的生物，其基因組相似度越高。然而共線性分析顯示，盡管金魚-鯉發(fā)生分化的時間（14.4Mya）比金魚-斑馬魚（60 Mya）要短，但金魚-鯉的染色體共線性程度卻更低（圖 2A），作者認為這可能是因金魚和鯉之間的物種分化所致。
除此之外，在多倍體植物中的研究顯示，全基因組復制會造成基因組不穩(wěn)定性升高、染色體重排頻發(fā)，并由此加速物種進化?。然而金魚-斑馬魚的基因組共線性結果卻顯示，金魚基因組倍增后并未發(fā)生大規(guī)模的重排現象（圖2B）。
圖2. 金魚-鯉、金魚-斑馬魚的染色體共線性分析
（A：金魚和鯉共線性，B：金魚和斑馬魚共線性，C：金魚染色體重排）
03
WGD后的基因演化
為了探究WGD事件后金魚基因組的演化情況，研究者們將金魚基因組與其近緣物種斑馬魚（二倍體）、草魚（二倍體）和鯉（四倍體）進行比較，分析了金魚在WGD后的基因丟失和保守非編碼元件丟失等，并通過基因表達分析，探究金魚基因功能的演化情況。
基因丟失情況
基因丟失（gene loss）往往緊跟WGD的步伐，如大西洋鮭在最近一輪全基因組復制后發(fā)生了快速的基因丟失，產生去四倍化現象? 。
基于斑馬魚：草魚：金魚：鯉=1：1：2：2的基因組倍性關系，同一斑馬魚基因（ortholog）理論上在金魚中應該對應兩個基因，這兩個基因互為旁系同源基因（paralogs），稱同源基因對（ohnolog pair，注1）。
該研究據此鑒定到了19040個直系-旁系同源基因簇（ortholog-paralog gene clusters），其中的12.4%（2341個）在金魚中丟失了一個拷貝（圖3A）。
在此基礎上對WGD后每百萬年的基因丟失率進行計算，結果顯示，金魚和鯉的基因丟失率在最近一次WGD（14.4 My）后均有所升高（圖3B）。
圖3. 斑馬魚、草魚、鯉和金魚之間的進化關系&基因丟失速率
（A中粉色代表保留的基因數，淺藍色代表保留的CNE數）
功能分析發(fā)現，金魚中與氧化還原酶活性、核酸酶活性和甲基轉移酶活性相關的基因更傾向丟失，而與蛋白結合和轉錄因子相關的基因則更傾向于保留，這可能由于發(fā)育相關的關鍵轉錄因子的劑量平衡一旦被打破，就可能會導致幼年個體發(fā)育紊亂或停滯，進而影響其適合度。
保守非編碼元件丟失情況
保守非編碼元件（conserved non-coding elements，CNE）通常分布于基因的上下游區(qū)域，作為基因調控網絡的核心元件調控基因表達，其丟失往往會影響基因的功能。
與斑馬魚相比，草魚基因組在40Ma內丟失的CNEs數目多達3611個，而金魚和鯉僅有329個，表明這些CNEs丟失可能發(fā)生在金魚-草魚分化之后和第四輪全基因組復制事件之前。
此外，對CNE的丟失率分析發(fā)現，金魚和鯉基因組中均有4316個CNEs存在單拷貝丟失，這很可能發(fā)生在二者WGD事件之后和物種形成之前的3Ma期間（圖3B）；而在物種形成后至今，金魚基因組有16102個CNEs成為單拷貝或完全丟失，鯉中則為28937個，均呈加速丟失的趨勢。
基因表達分化情況
WGD后通常會伴隨去多倍化，冗余的基因傾向于發(fā)生空間或功能上的分化，從而使新的基因組能最大限度地發(fā)揮作用并適應環(huán)境。
對金魚各組織的轉錄表達分析顯示，鑒定出的同源基因區(qū)域中，6.2%（649個）的同源基因對都存在其中一個基因在所有組織中均沉默的現象（可能發(fā)生了非功能化），并且這些沉默的基因有較高的外顯子丟失率；其余同源基因對中，29.7%出現表達分化，68.7%在至少3個組織中共表達，可見WGD后金魚基因組中同源基因對呈現較大的表達分化。
那么，造成這些同源基因出現表達分化的原因是什么呢？金魚的WGD事件相對較晚，這就使得從序列分化、外顯子丟失和CNE丟失角度出發(fā)去解釋同源基因對的表達模式成為可能。
研究者們將這些同源基因對分別按序列相似度（圖4B）、外顯子丟失數（圖4C）和CNE丟失數（圖4D）劃分等級后再對比表達差異情況，結果顯示，基因表達的分化程度隨序列相似性升高而降低、隨外顯子丟失數增加而升高，但與CNE丟失數的多少沒有明顯關系。
圖4. 金魚同源基因的表達受序列變化、外顯子缺失和CNE丟失的影響
功能分析發(fā)現，與免疫功能相關的基因序列相似性較低，而與代謝調節(jié)、發(fā)育和基因表達調控等基礎生物學功能相關的基因序列相似性則相對較高，暗示金魚演化過程中對免疫等不同功能的不同需求。
此外，研究還發(fā)現，CNE丟失但外顯子不丟失的情況下，同源基因對在不同組織間的表達差異較小，表明CNE的丟失會縮小同源基因對的空間表達差異，而不是造成一對同源基因產生表達分化。
最后，對9750個同源基因對的表達情況進行聚類（圖4E）發(fā)現，表達量最高的基因簇（cluster 10, 11, 12 and 15）中的絕大部分基因均未出現外顯子或CNE丟失的情況，這些基因主要編碼一些信號分子和轉錄因子。
圖4E. 9750對同源基因的表達聚類
WGD后基因的演化機制
通常情況下，WGD后同源基因對的演化方式有4種：① 一對同源基因均保留其祖先物種的表達模式，稱保守共表達（conserved coexpression）；②一對同源基因均保留祖先物種的部分表達模式，即亞功能化（subfunctionalization,sub-F）；③其中一個同源基因不再表達，發(fā)生非功能化（nonfunctionalization,non-F）；④其中一個同源基因產生新的功能，即新功能化（neofunctionalization, neo-F）。
為了確定金魚同源基因的演化機制是哪種，研究者們以斑馬魚為祖先物種，對金魚-斑馬魚同源基因的表達進行相關性分析，結果發(fā)現，金魚同源基因對間表達量的相關性（圖5A中GF1 vs GF2）高于金魚同源基因對表達量之和與斑馬魚直系同源基因的相關性（GF1+GF2 vs ZF），也高于金魚一對同源基因對中任一個與斑馬魚直系同源基因間的相關性（GF1/GF2 vs ZF）。這表明，金魚的基因組在WGD后發(fā)生了強的純化選擇來維持同源基因表達的劑量平衡（注2）。
圖5A. 斑馬魚-金魚基因組種同源基因表達的聚類熱圖
對比金魚-斑馬魚的基因表達情況，研究者們發(fā)現共表達和非功能化是金魚基因在WGD后的主要演化機制，并且同源基因主要通過新功能化來避免非功能化，而不是通過亞功能化（表1，此部分受分析方法影響較大，建議小伙伴們查看Methods，推薦給大家兩篇NG Correspondence 參考文獻6-7）。
表1. 文中鑒定到的發(fā)生不同類型演化的同源基因對情況
（注：這里的部分非功能化是指同源基因對中的一個基因在至少一個組織中發(fā)生非功能化，但在其他組織中共表達，其他亦同）
金魚WGD后同源基因對的不同演化類型與其基因結構變化之間有什么關系呢？研究者們發(fā)現，與其他三種類型相比，金魚基因組中發(fā)生共表達的基因具有較高的金魚-斑馬魚同源基因序列相似性（圖5C左）；而在非功能化的同源基因對中，表達了的ohnolog相比未表達的具有更高的外顯子保留率及金魚-斑馬魚序列相似性，表明外顯子丟失可能是造成非功能化的主要因素；外顯子丟失率分析發(fā)現，不同類型演化機制的同源基因對丟失率表現出：非功能化＞亞功能化/新功能化＞共表達的趨勢（圖5C右），表明外顯子數量變異在亞功能化和新功能化中也發(fā)揮一定作用。
圖5C. 不同類型演化機制的同源基因數量與斑馬魚-金魚序列一致性（左）及外顯子獲得/丟失率（右）間的關系
CNE獲得/丟失比例分析則顯示，新功能化/非功能化組中的同源基因比共表達組有更高的CNE獲得/丟失比例（圖6a），并且落在共表達和亞功能化組中的基因在斑馬魚中的表達量高于非功能化和新功能化組的（圖6b）；此外，落在亞功能化組中的斑馬魚基因所能表達的組織數目比非功能化和新功能化組中的要多（圖6c），這些表明金魚基因組中具有高表達和廣泛表達的基因在WGD后更可能發(fā)生了亞功能化。
圖6. 不同類型演化機制的同源基因數量與CNE獲得/丟失之間的關系
（不同類型同源基因對與CNE獲得/丟失（a）、基因表達強度（b）以及表達組織數（c）間的關系）
04
結論
該研究利用71X PacBio單分子測序對和金金魚進行了全基因組測序，獲得了高質量的金魚基因組組裝和注釋數據，推演金魚和鯉共同經歷的第四輪全基因組復制事件約發(fā)生于14 Mya，通過后續(xù)的一系列分析，得出以下主要結論：
（1）金魚兩個亞基因組間保持著較高的共線性，并與斑馬魚維持較高的共線性；
（2）第四輪全基因組復制事件后發(fā)生了快速的基因丟失，同時30%的保留基因在各組織間產生了表達分化；
（3）序列相似度、外顯子數量變異影響基因的功能分化，CNE數量變異影響不同組織間基因表達差異；
（4）WGD后ohnologs更傾向于經歷非功能化和新功能化，而不是亞功能化；
（5）外顯子數量變異是驅動脊椎動物多樣性產生的關鍵因素。
注1：同源基因的分類及說法
（1）同一物種的成對基因或染色體經歷物種形成及異源多倍化后在同一基因組中出現稱為Homoeologs（也有寫為homeolog，但homoeolog更常見）；Ohnologs為由于全基因組復制事件產生的基因。
（2）同源序列可分為兩種：直系同源（orthology）和旁系同源（paralogy）。直系同源（orthologs）由物種形成（speciation）產生：若一個基因原本存在于某個物種，而該物種分化為兩個物種，那么新物種中的基因即是直系同源；旁系同源（paralogs）由基因復制產生：若生物體中發(fā)生了基因復制，那么兩個副本序列就是旁系同源。旁系同源常見于同一物種，但也不是絕對如此，如鼠的α球蛋白和β球蛋白基因是paralog，鼠的α球蛋白和雞的β球蛋白基因的關系也是paralog。
同源基因分類，圖片來自參考文獻8
注2：選擇壓力
選擇壓力也被稱為進化壓力，即自然界施與生物體選擇壓力從而使適應環(huán)境者得以存活和繁衍。通常將選擇壓力分為三種，用堿基的非同義替換與同義替換比值ω（即Ka/Ks或dN/dS）進行區(qū)分：① 正選擇（Positive/Directional selection），保留有益變異，導致遺傳多樣性水平升高，ω>1的變異則為受到了正選擇；②中性選擇（Neutral selection），也稱平衡選擇（balancing selection），輕微有害卻不致命的變異通常受到中性選擇，ω=1；③ 負選擇（Negative selection），也稱為純化選擇（Purifying selection），剔除有害變異，導致遺傳多樣性水平降低，其ω<1。
(作者：陳琳等。來源：AGCT與魚)
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