水霉及水霉病防治的研究進(jìn)展

20 世紀(jì)60 年代， 我國學(xué)者曾將水霉劃入藻狀菌綱、水霉目、水霉科。隨著研究的深入， 許多研究者采用Ainsw orth 等真菌分類系統(tǒng)， 摒棄舊系統(tǒng)中藻狀菌分類說法， 將水霉分在真菌界、鞭毛菌門、卵菌綱、水霉目、水霉科。但隨著對卵菌綱生物的形態(tài)學(xué)、細(xì)胞學(xué)、生理學(xué)和分子生物學(xué)等方面的深入研究， 結(jié)果表明卵菌生活史的核循環(huán)、超微結(jié)構(gòu)、細(xì)胞壁成分、DNA 的GC百分比、賴氨酸生物合成途徑、色氨酸合成酶沉降圖型、25S rRNA 分子量等多方面性狀與其他真菌都迥然不同， 盡管在功能上與真菌相似， 實際上與真菌無近緣關(guān)系。此外， 分子系統(tǒng)發(fā)育學(xué)研究也顯示出卵菌綱不在真菌單元論起源的進(jìn)化路線上， 因此， 部分學(xué)者提出將卵菌綱從真菌界中獨立出來成為一個門， 與原來也作為真菌的絲壺菌門和網(wǎng)黏菌門一起被包括在茸鞭生物界中。因而，水霉被描述為具有一些真菌特征， 但非真菌的類真菌生物。

對于水霉的鑒定， 傳統(tǒng)分類方法主要是基于菌絲形態(tài)、新孢子囊產(chǎn)生方式、游動孢子釋放方式等， 而屬內(nèi)具體種類的鑒定則需要基于有性繁殖器官的準(zhǔn)確描述， 包括卵原細(xì)胞、雄器及卵孢子分化位置及數(shù)目等。然而許多從動物體上分離的菌株往往沒有有性結(jié)構(gòu)， 或這些結(jié)構(gòu)形成需要較長時間的發(fā)育， 或卵原細(xì)胞未成熟， 因而用形態(tài)學(xué)方法難以準(zhǔn)確鑒定取自魚體的水霉菌株， 確定水霉屬的具體種類還需尋找其他的方法， 比如DNA 指紋技術(shù)， 運用該方法鑒定了從鮭魚魚體上分離得到的水霉菌; 擴增多態(tài)性DNA 技術(shù)， 應(yīng)用該技術(shù)分析從鱒魚病灶分離的水霉菌株，發(fā)現(xiàn)這些菌株之間有85% ~ 100% 遺傳相似性， 可能屬于同一進(jìn)化分支， 而與 Saprolegnia diclina parasitica 僅有20% ~ 45% 的遺傳相似性， 此外， Bangy eekhun 等研究溝鯰水霉病病原特征， 利用RAPD 方法將分離得到的水霉菌株分為3 個不同組別; 核糖體rDNA 內(nèi)部轉(zhuǎn)錄間隔區(qū) ( Inter nal Tr anscribed Spacer， ITS) 序列分析法， 由于ITS 區(qū)域是中度保守區(qū)域， 其保守性基本上表現(xiàn)為種內(nèi)相對一致， 種間差異比較明顯， 且具有片段小， 易分析等優(yōu)點， 能夠?qū)嵸|(zhì)性反映出屬間、種間及菌株間的堿基對差異， 因而， 真菌分類學(xué)家越來越傾向利用ITS 序列分析技術(shù)作為水霉種間分析和種內(nèi)鑒定的分子標(biāo)記。Ke等通過分析比較分離自斑馬魚和異育銀鯽的2株水霉內(nèi)部轉(zhuǎn)錄間隔區(qū) ( ITS) ， 包括5. 8 S rDNA，確定了2 株水霉同屬于S. f er ax 的進(jìn)化支; 而通過將患病黃顙魚病灶處分離的水霉菌株 ( HSY) ITS 區(qū)序列( 包括5. 8S rDNA ) 與S. litoralis、S. bulbosa、S. oliviae、 S.longicaulis、S . ferax 、S. mixta 和S . anomalies的ITS 區(qū)序列( 包括 5. 8S rDNA ) 比較分析， 將HSY 菌株暫定為S. ferax。Hulvey 等分析56 個菌株ITS 區(qū)序列和28S rRNA 基因序列， 確定這些菌株分屬于10 個水霉物種分支。因此， 在水霉分類鑒定過程中， 應(yīng)以形態(tài)為基礎(chǔ)， 生理、生化、生態(tài)和分子等手段為輔進(jìn)行系統(tǒng)分類。

2 水霉生活史及其培養(yǎng)

2. 1 水霉的形態(tài)及生活史

水霉的菌絲為管形， 內(nèi)菌絲發(fā)達(dá)， 纖細(xì)而分枝繁多; 外菌絲中等粗壯， 無分隔。菌絲壁主要由葡聚糖組成，也含有纖維素和少量幾丁質(zhì)。在適當(dāng)環(huán)境條件下， 水霉菌絲發(fā)育為動孢子囊， 動孢子囊內(nèi)形成游動孢子， 游動孢子逸出方式因不同屬而異， 在水霉屬中， 動孢子囊頂端形成小孔，具有兩根頂生鞭毛的梨形孢子( 第一型游動孢子) 逸出， 經(jīng)過短期游動后，進(jìn)入靜止期， 而后在靜體上形成一個具有兩根側(cè)生鞭毛的腎形孢子( 第二型游動孢子) ，再經(jīng)過短時間游動后就休止， 休止孢子萌發(fā)成芽管， 芽管發(fā)育成新的菌絲。然而當(dāng)外菌絲處于不良環(huán)境條件時， 會形成一竄念珠狀的芽孢，這些芽孢一遇到適宜環(huán)境， 就可萌發(fā)成菌絲或形成動孢子囊。新孢子囊的再生方式有兩種， 一種是從空孢子囊中繼續(xù)長出一個新孢子囊， 另一種是從空孢子囊基部側(cè)生出一個新孢子囊。

水霉的無性繁殖主要借助梨形和腎形兩種形態(tài)截然不同的雙鞭毛游動孢子。游動孢子在生活史中的作用是進(jìn)行短距離游動，以找到潛在基質(zhì)和寄主， 最后形成芽管以產(chǎn)生新的菌絲。水霉的有性繁殖則是通過異性配子囊配合方式發(fā)生， 當(dāng)條件有利于有性生殖時， 營養(yǎng)菌絲上便形成較大的球狀藏卵器和較小的菌絲狀雄器。藏卵器球形或梨形，多數(shù)頂生， 少數(shù)側(cè)生。藏卵器具有雄性器官， 雄器短而粗與藏卵器同枝， 包括同體和同枝， 少數(shù)異枝。減數(shù)分裂則在配子囊內(nèi)發(fā)生， 雄器通過受精管穿過藏卵器壁到達(dá)卵球，進(jìn)行質(zhì)配和核配。受精后形成卵孢子， 卵孢子分化呈中央型或亞中央型， 每個藏卵器3~ 25 個卵孢子不等， 卵孢子由藏卵器壁的分解而釋出，經(jīng)過3~ 4 個月休眠后萌發(fā)產(chǎn)生具有短柄的動孢子囊或菌絲， 完成整個生活史。

2. 2 水霉的實驗室培養(yǎng)

典型誘導(dǎo)水霉的方法是在池塘或養(yǎng)殖魚場取水樣，加入油菜籽、玉米粒等種子作誘餌， 誘導(dǎo)水霉生長， 并進(jìn)行分離純化逐步得到純培養(yǎng)物。水霉易于分離和培養(yǎng)， 不過因為不易和細(xì)菌分開， 純培養(yǎng)較為困難。目前水霉純培養(yǎng)多采用連續(xù)多次把誘出的菌絲體移入無菌水中的方法，此法易受腐霉 ( Fythium spp. ) 、浮游生物和鐮刀菌( Fusariumspp. ) 的污染， 純化較為困難， 而先從水樣中誘出水霉菌或從患水霉病魚病灶處獲得水霉菌， 再用單孢子分離法將水霉菌分離到玉米粉瓊脂培養(yǎng)基上培養(yǎng)，能夠避免以上因素的影響， 是較為理想的純培養(yǎng)方法。為了防止純培養(yǎng)過程中水霉菌受污染， 通常會選擇在玉米粉瓊脂培養(yǎng)基中加入一定濃度的硫酸鏈霉素。在實驗室純培養(yǎng)過程中，菌絲及無性繁殖的適宜溫度約為25℃ ; 當(dāng)溫度低于25℃時， 溫度越低，誘發(fā)水霉所需時間越長， 菌絲越短、直徑越小， 動孢子囊直徑越小， 游動孢子數(shù)目越少;當(dāng)溫度高于25℃時， 延長了誘發(fā)時間并抑制了菌絲及動孢子囊的生長。當(dāng)溫度為15~ 17 ℃時， 水霉能很快進(jìn)入有性生殖階段， 而溫度超過20℃時則不能誘導(dǎo)有性生殖。

3 ??水霉病病原研究

水霉病給水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)造成巨大經(jīng)濟損失，國內(nèi)外水產(chǎn)養(yǎng)殖場都有發(fā)生水霉病的報道。水霉是引起魚類發(fā)生水霉病的主要病原， 其適應(yīng)溫度范圍廣， 分布范圍亦很廣， 一年四季都可以引起魚類發(fā)病。早在17 世紀(jì)80 年代就有許多科學(xué)家研究魚類水霉病。然而， 查明病原體往往比較困難， 尤其對于取自魚體病灶和被感染魚卵的菌株，因為分離得到的種類在體外培養(yǎng)過程中往往不能產(chǎn)生有性結(jié)構(gòu)。國外學(xué)者通過研究鱒魚、鯉魚等魚的水霉病， 認(rèn)為水霉病的病原體為 S. torulosa、S. ferax、S. monoica 及Achlya nowickii 等。隨后Coker將從患水霉病魚及魚卵分離得到的菌株命名為S. parasitica。國內(nèi)學(xué)者通過研究施氏鱘水霉病， 根據(jù)形態(tài)及生理學(xué)特征將施氏鱘水霉病原鑒定為 S . parasitica， 并提出孢子表面毛紋飾的不同形態(tài)有助于孢子黏附到魚體表， 進(jìn)而引發(fā)魚體發(fā)生水霉感染的觀點。李愛華等初步研究花鱸水霉病， 根據(jù)菌絲形態(tài)及動孢子囊特征認(rèn)為病原為水霉屬種類， 由于未能觀察到或培養(yǎng)出有性生殖器官而尚未確定具體種類，并提出水霉感染發(fā)生是在細(xì)菌和病毒感染后的繼發(fā)感染。Jo hnso n 等提出水霉包括17 屬， 122種。但是， 對養(yǎng)殖魚類危害較大的常見種類不多，主要有S . ferax 、 S. monoica、S. diclina、S. parasitica 等。

水霉對宿主無嚴(yán)格的選擇性， 在水生動物的各個生長階段均有發(fā)生， 主要寄生在魚體傷口和死卵上， 危害養(yǎng)殖魚類和降低魚卵孵化率。除魚卵外， 魚類水霉病均非原發(fā)性疾病， 而是繼發(fā)性疾病。當(dāng)魚類皮膚或鰓受到機械損傷及其他病原體的傷害時， 魚體抵抗力降低， 水霉孢子在傷口處萌發(fā)并開始寄生。Bly 等通過研究溝鯰水霉病表明， 只有當(dāng)鯰魚免疫力迅速下降才會被水霉菌感染， 而健康魚體不會感染水霉。

4 ??水霉病藥物防治研究

4. 1 ??化學(xué)藥物防治

水霉病是困擾水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的重要疾病， 一直以來主要用化學(xué)藥物治療。Foster 等首次應(yīng)用孔雀石綠預(yù)防魚卵水霉病， Arasaki 等證實了該藥物的效果， 并指出0. 02 mg/ L 能夠抑制菌絲的生長， 且0. 2 mg/ L 能夠抑制動孢子囊和厚垣孢子的萌發(fā)。自20 世紀(jì)30 年代， 由于孔雀石綠操作方便、價格低廉和效果明顯， 因而被廣泛使用在水產(chǎn)養(yǎng)殖上。此外， 研究表明， 甲醛在18. 8 mg / L質(zhì)量濃度下即對水霉孢子表現(xiàn)出明顯的抑制作用，在24 mg/ L 質(zhì)量濃度下浸泡2 h 以上對水霉菌絲開始有殺滅作用， 而Gieseker 等發(fā)現(xiàn)用37mg / L 甲醛質(zhì)量濃度藥浴感染水霉病的虹鱒， 其死亡率最低， 約為29% 。含有效碘質(zhì)量濃度為1 mg / L 的碘伏對水霉的殺菌率超過99%。由于水霉絕大多數(shù)存在于淡水中，較高的鹽分限制了水霉的分布， 因而食鹽也成為治療水霉病的常見化學(xué)藥物之一， 當(dāng)NaCl 質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%、2 % 時， 水霉生長被顯著抑制， 而NaCl 質(zhì)量分?jǐn)?shù)大于3%時， 水霉則完全不能生長。

盡管孔雀石綠能較好殺滅水霉菌， 但是研究發(fā)現(xiàn)， 孔雀石綠能在魚體內(nèi)長時間殘留， 并可通過食物鏈對哺乳動物和人類產(chǎn)生致畸、致癌、致突變等作用; 甲醛具有辛辣強烈刺激性， 并且對人體還有致突變和致癌等危害作用; 而碘伏對哺乳動物細(xì)胞也有一定潛在的毒性， 長期應(yīng)用碘或碘化物也可引發(fā)一系列中毒癥狀。此外， 這些化學(xué)藥品的長期使用會污染水環(huán)境。因此， 傳統(tǒng)化學(xué)藥物的危害已引起人們的高度重視， 一些國家已禁止在食用魚類養(yǎng)殖過程中使用孔雀石綠和甲醛。近年來國際上一些研究者已開始研究開發(fā)新型有效藥物，如腐殖酸、二氧化氯、氫過氧化物、溴硝丙二醇等， 其殺蟲、殺菌效果與孔雀石綠相當(dāng)， 但其安全性能還有待進(jìn)一步確認(rèn)， 而且這些藥物并非是防治魚類水霉病的最佳選擇。目前， 英國研制了一種防治水生動物真菌感染的藥物Pyceze， 其主要活性成分是“bronopol”??， 可用于處理魚體及魚卵， 能夠安全有效地防治真菌感染。

4. 2 ??生物防治研究

目前發(fā)現(xiàn)一些細(xì)菌對水產(chǎn)動物病原菌有拮抗作用。因此， 利用生物拮抗作用控制水產(chǎn)動物病害的生物防治也日益受到重視。研究表明， 從患水霉病魚體的損傷處分離出假單胞菌屬和氣單胞菌屬的細(xì)菌， 均能抑制水霉的生長， Lategan 等利用中間氣單胞菌A199 能夠有效治療人工感染水霉的澳洲鰻鱺及自發(fā)感染水霉的澳洲銀鱸。此外， 從發(fā)生過水霉病害的養(yǎng)殖水體中分離篩選出的黏質(zhì)沙雷氏菌對水霉菌絲和孢子均有較強抑制作用， 黏質(zhì)沙雷氏菌抑制真菌生長的機制在于其能產(chǎn)生幾丁質(zhì)酶， 分解真菌孢子及營養(yǎng)體中的幾丁質(zhì)成分， 從而可以破壞真菌結(jié)構(gòu)。

近年來， 由多種微生物復(fù)合而成的微生態(tài)制劑在水產(chǎn)養(yǎng)殖動物病害防治中越來越受到重視， 并發(fā)揮著調(diào)節(jié)養(yǎng)殖環(huán)境， 控制病害的作用。有效微生物制劑是日本琉球大學(xué)比嘉照夫教授等首先研制的由5 科10 屬80 余種有益微生物組成的高效能的微生物復(fù)合劑。在黃顙魚卵孵化水中， 當(dāng)有效微生物制劑濃度增至8μl/ L 時， 水霉病的發(fā)生率為5. 82% ; 當(dāng)有效微生物制劑濃度增至 16μl / L 時再加入50μl/ L 重氫硫酸鹽后， 可極顯著地抑制水霉病的發(fā)生， 水霉病的發(fā)生率幾乎為0。有效微生物制劑及其增效劑能有效控制水霉病的發(fā)生原因主要有: 一是能保持水體益生菌種群數(shù)量， 穩(wěn)定水體pH 值， 補充微量元素; 二是有效微生物制劑抑制了水體水霉的生長繁殖， 使魚種在池塘中體質(zhì)盡快恢復(fù)， 傷口盡快愈合。應(yīng)用臭氧配合復(fù)合光合細(xì)菌處理高密度虹鱒養(yǎng)殖水體， 結(jié)果表明， 時隔4d 用臭氧處理1 次水體， 次日投放5% 復(fù)合光合細(xì)菌可有效治療水霉病， 而時隔1 周用臭氧處理1 次水體， 次日投放1% 復(fù)合光合細(xì)菌可有效預(yù)防水霉病的發(fā)生[ 71]。因此， 在水產(chǎn)養(yǎng)殖中， 合理使用復(fù)合微生態(tài)制劑拌餌投喂和定期凈化水質(zhì)對水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的經(jīng)濟效益和生態(tài)效益將會產(chǎn)生深遠(yuǎn)影響。

4. 3 ??中草藥防治研究

中草藥具有抗菌、抗病毒、增強免疫功能， 改善和提高機體抗病能力等作用， 以及副作用少、毒性低、不易產(chǎn)生抗藥性等特點， 加之中草藥本身含有一定營養(yǎng)物質(zhì)， 如粗蛋白、粗脂肪、維生素等， 可以提高飼料轉(zhuǎn)化率等特點， 近年來被廣泛用于防治各類水生經(jīng)濟動物病害和作為飼料添加劑應(yīng)用于水產(chǎn)養(yǎng)殖中。研究表明， 五倍子或菖蒲能有效地防治魚類水霉病的發(fā)生， 菖蒲結(jié)合化學(xué)消毒劑強氯精能有效治療尼羅羅非魚水霉病。李川等用中草藥對患水霉病大鯢進(jìn)行治療， 結(jié)果顯示大黃和五倍子兩種藥液均對水霉菌有較好的抑制作用，當(dāng)大黃質(zhì)量濃度為0. 4g/ L ( 即用量為大黃干品400g/ m3水體) 時， 對水霉菌有最佳的治療效果。

中草藥可通過阻斷或破壞真菌結(jié)構(gòu)及大分子的生物合成、干擾真菌的能量代謝， 或通過調(diào)節(jié)生物體免疫功能和對其他抗真菌藥物的增效作用來殺滅或抑制真菌， 隨著提取、分離和結(jié)構(gòu)鑒定技術(shù)的迅速發(fā)展， 許多抗真菌有效成分得到一定的發(fā)掘。中草藥的化學(xué)成份極為復(fù)雜， 其中能防治疾病的有效成份主要包括多糖、生物堿、甙類、揮發(fā)油、萜類、鞣質(zhì)、酮類、蛋白質(zhì)等。然而在中草藥研究方面還需要建立中草藥抗真菌作用的篩選標(biāo)準(zhǔn)，分離確認(rèn)安全高效成分， 積極開展中草藥抗真菌分子機理研究， 以及中草藥抗真菌藥物減毒增效作用研究， 進(jìn)一步發(fā)掘中草藥在水產(chǎn)養(yǎng)殖病害防治和免疫增強方面的應(yīng)用。在魚類各種疾病預(yù)防和治療中，中草藥都有一定的效果， 值得研究和開發(fā)，而目前， 魚用中成藥的研究剛剛起步， 今后應(yīng)加強研發(fā)力度， 使中草藥在魚病防治中發(fā)揮更大作用。

5 結(jié)語

水霉病是養(yǎng)殖水產(chǎn)動物的常見病， 其病原是水霉科的一些種類，其生活史復(fù)雜， 對其是真菌還是類真菌生物還存在爭議， 鑒定種類應(yīng)結(jié)合傳統(tǒng)形態(tài)特征和分子生物學(xué)技術(shù)， 才能作到準(zhǔn)確快速。過去一直使用的防治水霉病的有效藥物孔雀石綠和甲醛，由于其高殘留和強毒性作用， 已被我國和其他國家政府禁用， 目前， 急需要開發(fā)出能替代上述禁用漁藥的替代品。目前， 正篩選安全有效的化學(xué)藥物和中草藥， 以及采用生物防治方法控制水霉病，都取得了一些進(jìn)展。尤其是通過微生態(tài)制劑調(diào)節(jié)水環(huán)境，以及使用中草藥制劑， 對水霉病有明顯控制作用， 兩者無殘留、無污染， 值得進(jìn)一步深入研究， 開發(fā)出安全、有效的綜合防治水霉病的制劑。

  (《水產(chǎn)科學(xué)》陳本亮 張其中)