兩種厚頜魴野生群體的遺傳多樣性差異

厚頜魴(Megalobrama pellegrini)俗稱烏鳊, 隸屬于鯉形目(Cypriniformes)、鯉科(Cyprinidae)、  鲌亞科(Cultrinae)、魴屬(Megalobrama)[1], 是長江上游特有的經(jīng)濟(jì)魚類之一.厚頜魴曾被認(rèn)為是三角魴(M. terminali)的同種異名, 后經(jīng)羅云林[2]對魴屬物種的性狀差異進(jìn)行詳細(xì)分析后, 將其確立為有效種.然而, 近年來, 由于棲息地不斷被破壞、片段化以及過度捕撈等人為因素的影響, 厚頜魴的種群數(shù)量處于急劇下降趨勢[3, 4].同時, 三峽大壩及長江上游梯級電站的陸續(xù)開發(fā)嚴(yán)重改變了長江上游的水文環(huán)境,如原來的流水環(huán)境變成靜水環(huán)境, 這對厚頜魴這種在繁殖季節(jié)對流水條件要求較為苛刻的物種來說無疑是一種毀滅性的破壞[5].據(jù)調(diào)查, 目前厚頜魴在長江上游的干流及其大型支流基本絕跡, 僅于長江上游的一級支流--龍溪河尚存在種群規(guī)模的野生厚頜魴群體[3], 而且研究表明, 此水域的厚頜魴種群資源由于過度開發(fā)其資源量仍處于下降趨勢[4].劉軍[6]曾根據(jù)瀕危系數(shù)、遺傳損失系數(shù)和物種價值系數(shù)將魚類的優(yōu)先保護(hù)順序劃分為四個級別, 厚頜魴已達(dá)到三級急需保護(hù)物種.

生物的遺傳多樣性水平是長期進(jìn)化的產(chǎn)物, 是評估生物資源現(xiàn)狀的一個重要參數(shù), 遺傳多樣性越高, 即遺傳變異越豐富, 則對環(huán)境的適應(yīng)能力就越強, 其生存的競爭力就越強.然而, 目前關(guān)于厚頜魴遺傳多樣性的研究較少.劉煥章和汪亞平[8]基于同功酶標(biāo)記對厚頜魴合江群體的遺傳多樣性進(jìn)行了初步評估; Wang 等[9]基于微衛(wèi)星標(biāo)記對厚頜魴龍溪河群體的遺傳多樣性進(jìn)行了初步評估,得到的結(jié)果均顯示厚頜魴群體的遺傳多樣性水平較低.本研究同時采用核基因標(biāo)記--微衛(wèi)星標(biāo)記(Simple se-quence repeat, SSR) 和線粒體標(biāo)記 (Mitochondrial DNA,mtDNA)--細(xì)胞色素 b 基因(Cytb)與控制區(qū)(D-loop)序列,分別對龍溪河水域及球溪河水域的厚頜魴野生群體的遺傳多樣性進(jìn)行比較分析, 試圖從分子水平比較這兩個厚頜魴野生群體的遺傳多樣性差異, 以期為厚頜魴的種群復(fù)壯和種質(zhì)資源的合理開發(fā)與利用等保護(hù)管理研究提供有價值的科學(xué)依據(jù).

1 材料與方法

1.1 材料

本研究中的 2 個厚頜魴野生群體分別來源于長江上游的一級支流--龍溪河, 以及沱江的一級支流--球溪河.其中, 厚頜魴龍溪河群體(LXH)于 2010 年不同時段采自四川省瀘州市龍溪河(同 Wang 等[9]中的野生群體),實驗樣本量(Number of individuals, N)共計 30 尾; 厚頜魴球溪河群體(QXH)于 2011 年 10 月購自四川省瀘州市龍陽區(qū)漁種站(該群體來源于近幾年球溪河水域的野生厚頜魴作為親本經(jīng)人工繁殖得到的子一代群體, 且親本數(shù)在 10對以上, 故本研究將其視為"野生群體"), 實驗樣本量(N)共計 32 尾.上述兩個群體的代表樣本均是隨機取樣, 且每尾標(biāo)本分別取其新鮮肌肉與鰭條于 95%酒精中固定,–20℃保存?zhèn)溆?

1.2 基因組 DNA 的提取

樣品基因組 DNA 的提取采用 DNeasy Blood andTissue kit(QIAGEN)試劑盒, 具體步驟參照試劑盒手冊.

1.3 引物設(shè)計及 PCR 擴(kuò)增

微衛(wèi)星標(biāo)記: 參考 Wang 等[9]研究中開發(fā)的厚頜魴多態(tài)性微衛(wèi)星標(biāo)記, 本研究共選取 10 個多態(tài)性相對較高(如多態(tài)信息含量>0.5)且未偏離哈迪-溫伯格平衡的微衛(wèi)星標(biāo)記(MP8、MP14、MP15、MP16、MP17、MP28、MP32、MP40 、 MP45 和 MP48) ( 登錄號分別是 : JQ087472 、JQ087475、JQ087476、JQ087477、JQ087478、JQ087483、JQ087486、JQ087488、JQ087492、JQ087494).具體的引物序列、PCR 擴(kuò)增、產(chǎn)物檢測及其記數(shù)等詳見 Wang 等[9].線粒體標(biāo)記: Cytb 基因片段的引物為通用引物L(fēng) 1 4 7 2 4 ( 5   - G A C T T G A A A A A C C A C C G T T G - 3   ) 和H15915(5 -CTCCGATCTCCGGATTACAAGAC-3 )[ 10];D-loop 片段的引物為本研究設(shè)計的厚頜魴特異性引物MP-CR_F(5 -CGGTCTTGTAATCCGAAGATCG-3 )和MP-CR_R(5 -CATGTGTAAGTCGGGTAAGAGCTG-3 ).

PCR 反應(yīng)總體系為 25 μL, 其中, 10×Buffer (TaKaRa)2.5 μL, MgCl2(30 mnol/μL) 1.5 μL, dNTPs (10 mmol/L)2 μL, 上下游引物(10 μmol/L)各 1 μL, rTaq 聚合酶9 (TaKaRa) 1U, 模板 DNA 100 ng.反應(yīng)條件: 94℃預(yù)變性2min; 隨后 30 個循環(huán), 每一次循環(huán)的參數(shù)設(shè)置為 94℃變性 30s, 56℃退火 30s, 72℃延伸 90s; 最后 72℃終延伸7min.PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物于 1%瓊脂糖凝膠電泳檢測, 然后直接由華大基因(BGI)完成純化回收及雙向測序工作.

1.4 數(shù)據(jù)分析

微衛(wèi)星標(biāo)記: 應(yīng)用軟件 POPGENE 1.31[11]、CERVUS3.0.3[12]和 Arlequin 3.5[13]分別完成對厚頜魴遺傳結(jié)構(gòu)的分析, 計算的基本參數(shù)主要有: 等位基因數(shù)(Number ofAllele, Na)、觀測雜合度(Observed Heterozygosity, Ho)、期望雜合度(Expected Heterozygosity, He)、多態(tài)信息含量(Polymorphic Information Content, PIC)、哈迪-溫伯格平衡(Hardy-Weinberg Equilibrium, HWE) 、 遺 傳 分 化 指 數(shù)(Fixation Index, Fst)和分子方差分析(Analysis of MolecularVariance, AMOVA)等.

線粒體標(biāo)記: 測序獲得的 Cytb 與 D-loop 序列集分別由Clustal X 軟件[14]、Seaview 軟件[15]進(jìn)行編輯、校正和比對.通過 DnaSP 5.0 軟件[16]統(tǒng)計各群體的單倍型數(shù)(Haplotype,H)、單倍型多樣性指數(shù)(Haplotype diversity, Hd)、變異位點數(shù)(Variable site, V)、核苷酸多態(tài)樣性指數(shù)(Nucleotide diver-sity, Pi)等.使用 Arlequin 3.5 軟件[13]計算兩兩群體間的 Fst值, 并進(jìn)行 AMOVA 分析.單倍型間遺傳距離通過 1000 次重抽樣進(jìn)行顯著性檢驗.單倍型序列由 Sequin 12.30 軟件(NCBI)完成注釋, 并提交至 GenBank 獲取序列號.

2 結(jié)果

2.1 厚頜魴龍溪河群體與球溪河群體的遺傳多樣性

基于10個微衛(wèi)星標(biāo)記計算出的厚頜魴龍溪河群體與球溪河群體的遺傳多樣性結(jié)果如表 1 所示.龍溪河群體所檢測到的微衛(wèi)星平均等位基因數(shù)為 3.8 個, 平均觀測雜合度為 0.63, 平均期望雜合度為 0.62, 平均多態(tài)信息含量為0.54, 其遺傳多樣性呈中等水平.而與龍溪河群體相比,球溪河群體的遺傳多樣性與之相當(dāng), 如: 平均等位基因數(shù)為 3.7 個,平均觀測雜合度為 0.64, 平均期望雜合度為0.64, 多態(tài)信息含量為 0.55.此外, 10 個微衛(wèi)星標(biāo)記中有 5個位點(MP16、MP17、MP28、MP40 和 MP45)在球溪河群體中顯著或極顯著地偏離了哈迪-溫伯格平衡(P<0.05).

基于線粒體標(biāo)記計算出的兩個厚頜魴野生群體的遺傳多樣性結(jié)果如表 2 所示.經(jīng)比對得到的 Cytb 片段與D-loop 片段的大小分別為 1121 和 937 bp, 均無插入、缺失.Cytb 片段在兩個野生群體(共計 62 個個體)中共檢測到 4 個變異位點, 2 種單倍型(Ha1、Ha2); 其中, 在龍溪河群體的 30 個個體中只檢測到一種單倍型(Ha1; GenBank登錄號 KC425463), 因此, 單倍型多樣性指數(shù)(Hd)、變異位點數(shù)(V)、核苷酸多樣性指數(shù)(Pi)均為 0, 顯示其遺傳多樣性水平極低; 而在球溪河群體中除了擁有 Ha1 單倍型(GenBank 登錄號 KC425464)外, 還檢測到第 2 種單倍型(Ha2; GenBank 登錄號 KC425465), 表現(xiàn)出的多樣性比龍溪河群體略高(Hd=0.272, V=4, Pi=0.00097).與 Cytb 片段相比, D-loop 片段表現(xiàn)出更高的序列變異, 在兩個群體(共計 62 個個體)中共檢測到 19 個變異位點, 組成 6 種單倍型; 其中, 在龍溪河群體中共檢測到 2 種單倍型(Ha1、Ha2; GenBank 登錄號分別為 KC425466 和 KC425467), 在球溪河群體中共檢測到 5 種單倍型(Ha1、Ha3、Ha4、Ha5、Ha6; GenBank 登錄號 KC425468-KC425472).與 Cytb的結(jié)果相似, D-loop片段的計算結(jié)果同樣顯示厚頜魴球溪河群體的遺傳多樣性水平比龍溪河群體的遺傳多樣性高(龍溪河群體: H=2, Hd=0.239, V=3, Pi=0.00077; 球溪河群體: H=5, Hd=0.423, V=15, Pi=0.00243).

2.2 厚頜魴龍溪河群體與球溪河群體的間遺傳分化

分別基于微衛(wèi)星標(biāo)記與線粒體 DNA 標(biāo)記(Cytb 和D-loop)對厚頜魴龍溪河群體與球溪河群體間的遺傳分化進(jìn)行分子方差分析(AMOVA)、遺傳分化指數(shù)(Fst)計算, 并進(jìn)行顯著性檢驗(表 3).結(jié)果表明, 遺傳變異主要發(fā)生在群體內(nèi)(87.62%-91.66%)而非群體間, 且龍溪河群體與球溪河群體間存在顯著的遺傳分化(Fst=0.083-0.124,P<0.05).

3 討論

3.1 遺傳標(biāo)記的選擇

DNA 分子標(biāo)記是基因的直接反應(yīng), 不受環(huán)境和其他因素的影響, 無組織特異性, 不受基因表達(dá)與否的影響,具有數(shù)量豐富、多態(tài)性強及操作簡便等特點.其中, 微衛(wèi)星標(biāo)記與線粒體 DNA 由于突變速率快、多態(tài)性高等特性已被廣泛應(yīng)用于種群遺傳結(jié)構(gòu)等方面的研究[17-19].在本研究中, 10 個微衛(wèi)星標(biāo)記與 D-loop 片段在兩個群體中分別表現(xiàn)出多態(tài), 但與之相比, Cytb 基因片段在野生群體的30 個個體中沒有檢測到變異位點, 在球溪河群體的 32 個個體中也只檢測到 4 個變異位點, 2 個單倍型.理論上,D-loop 作為一個非編碼區(qū)所承受的選擇壓力較蛋白編碼基因 Cytb 要小的多(即約束力相對小), 通常情況下,D-loop 片段的進(jìn)化速率普遍要高于 Cytb 基因的進(jìn)化速率,如 McMillan 和 Palumbi[20]曾指出蝴蝶魚的 D-loop 片段的進(jìn)化速率非常快, 是 Cytb 序列進(jìn)化速率的 33-43 倍.因此, 本研究選擇的微衛(wèi)星標(biāo)記與 D-loop 片段較 Cytb 片段更適合作為檢測厚頜魴群體遺傳變異的有效標(biāo)記.

3.2 哈迪-溫伯格平衡

本研究采用的 10 個微衛(wèi)星標(biāo)記中有 5 個位點(MP16、MP17、MP28、MP40 和 MP45)在球溪河群體中顯著或極其顯著地偏離了哈迪-溫伯格平衡(表 1).在種群遺傳學(xué)研究中, 經(jīng)常會出現(xiàn)偏離哈迪-溫伯格平衡的現(xiàn)象, 主要原因有華倫德效應(yīng)(Wahlund effect)、近親交配(inbreeding)、無效等位基因(Null alleles)等致使的雜合度不足等[21].在球溪河群體中, 位點 MP16、MP17、MP28 及 MP40 存在純合子過?，F(xiàn)象(Ho<He), 而在位點 MP45 則存在著雜合子過?，F(xiàn)象(Ho>He).而球溪河群體源自于人工繁殖的子一代, 有限的親本數(shù)量很可能導(dǎo)致近親交配, 這就不難理解為何在球溪河群體中有 5 個位點都偏離哈迪-溫伯格平衡.

3.3 遺傳多樣性

厚頜魴是我國長江上游地區(qū)的特有魚類, 具有重要的生態(tài)價值和遺傳價值.本研究首次采用微衛(wèi)星標(biāo)記和線粒體 DNA 標(biāo)記(Cytb 和 D-loop)對龍溪河和球溪河水域的厚頜魴野生群體的遺傳多樣性進(jìn)行了評估.其中, 微衛(wèi)星標(biāo)記的分析結(jié)果顯示, 與長江上游其他特有物種相比,如圓口銅魚(Coreius guichenoti)[22]、稀有 鯽(Gobiocyprisrarus)[23]、巖原鯉(Procypris rabaudi)[24], 厚頜魴龍溪河群體與球溪河群體的遺傳多樣性均處于中等偏低水平.而從線粒體 DNA 分析的結(jié)果來看, 兩個群體的單倍型多樣度(Hd)與核苷酸多樣度(Pi)均較小(Hd<0.5, Pi<0.5%), 暗示厚頜魴自然群體近期可能經(jīng)歷過瓶頸效應(yīng)(Bottleneckeffect)[25].此外, 線粒體 DNA 數(shù)據(jù)的分析結(jié)果顯示球溪河群體較龍溪河群體的遺傳多樣性更高.用于本研究中的厚頜魴球溪河群體來自于球溪河親本人工繁殖的子 1 代,雖然球溪河水域尚有厚頜魴的蹤影, 但卻很難再捕撈到種群規(guī)模的厚頜魴樣本.由此可見, 即使目前棲息于球溪河水域的野生厚頜魴數(shù)量極其有限, 但仍保存著略高于龍溪河水域厚頜魴的遺傳多樣性.因此, 源于球溪河水域的野生厚頜魴較龍溪河水域的野生厚頜魴更適用于人工繁殖, 對其種群資源的復(fù)壯具有更顯著的價值.

3.4 遺傳分化

遺傳分化指數(shù) Fst是揭示群體間遺傳分化程度的重要參數(shù).本研究基于微衛(wèi)星標(biāo)記、Cytb 和 D-loop 片段計算出的厚頜魴龍溪河群體與球溪河群體間的遺傳分化指數(shù)分別為 0.083、0.124 和 0.090, 根據(jù) Wright[26]對 Fst值的劃分顯示, 本研究中的這兩個野生厚頜魴群體間存在著中等程度的遺傳分化.我們分析存在這一現(xiàn)象的主要原因是地理阻隔, 因為龍溪河河口上游存在一個天然懸崖,形成了龍溪河和長江干流之間的天然阻隔[3], 從而導(dǎo)致龍溪河水域的厚頜魴群體與球溪河(沱江一級支流)水域的厚頜魴野生群體難以進(jìn)行基因交流.

總之, 根據(jù)本研究的結(jié)果, 我們認(rèn)為在野生厚頜魴資源一時難以大量發(fā)現(xiàn)和獲取的現(xiàn)狀下, 現(xiàn)有來自于球溪河的野生群體和人工繁殖子一代群體具有重要的保護(hù)和利用價值.

參考文獻(xiàn):

[1] Ding R H. Fishes of Sichuan [M]. Chengdu: Sichuan Scienceand Technology Press. 1994, 238-240 [丁瑞華. 四川魚類志. 成都: 四川科學(xué)技術(shù)出版社. 1994, 238-240]

[2] Luo Y L. A revision of fishes of the cyprinid genus Megalo-brama [J]. Acta Hydrobiological Sinica, 1990, 14(2):160-165 [羅云林. 魴屬魚類的分類整理. 水生生物學(xué)報,1990, 14(2): 160-165]

[3] Li W J. Research on the biology and ecology of Megalo-brama pellegrini, an endemic fish of the upper Yangze River[D]. Ph D dissertation. Huazhong Agricultural University,Wuhan. 2006 [李文靜. 厚頜魴的個體生物學(xué)和種群生態(tài)研究. 博士學(xué)位論文, 華中學(xué)業(yè)大業(yè), 武漢. 2006]

[4] Gao X, Tan D Q, Liu H Z, et al. Exploitation status andconservation of a population of Megalobrama pellegrini inLongxi River in the upper Yangzer River Basin [J]. SichuanJournal of Zoology, 2009, 28(3): 329-333 [高欣, 譚德清,劉煥章, 等. 長江上游龍溪河厚頜魴種群資源的利用現(xiàn)狀和保護(hù). 四川動物, 2009, 28(3): 329-333]

[5] Cao W X. The nature reserve construction for the endemicfishes in the upper Yangtze River and the related problems[J]. Resources and Environment in the Yangtze Basin, 2000,9(2): 131-132 [曹文宣. 長江上游特有魚類自然保護(hù)區(qū)的建設(shè)及相關(guān)問題的思考. 長江流域資源與環(huán)境, 2000, 9(2):131-132]

[6] Liu J. A quantitative analysis on threat and priority ofconservation order of the endemic fishes in upper reaches ofthe Yangtze River [J]. China Environmental Science, 2004,24(4): 395-399 [劉軍. 長江上游特有魚類受威脅及優(yōu)先保護(hù)順序的定量分析. 中國環(huán)境科學(xué), 2004, 24(4):395-399]

[7] Wang J W, Tan D Q, Li W J. Preliminary studies on artificialpropagation and embryonic development of Megalobramapellegrini [J]. Acta Hydrobiological Sinica, 2005, 29(2):130-133 [王劍偉, 譚德清, 李文靜. 厚頜魴人工繁殖初報及胚胎發(fā)育觀察. 水生生物學(xué)報, 2005, 29(2): 130-133]

[8] Liu H Z, Wang Y P. Studies on genetic structure and nullallele in a natural population of Megalobrama pellegrini [J].Acta Hydrobiological Sinica, 1997, 21(2): 194-196 [劉煥章, 汪亞平. 厚頜魴種群遺傳結(jié)構(gòu)及啞基因問題. 水生生物學(xué)報, 1997, 21(2): 194-196]