微生物檢測(cè)常見(jiàn)細(xì)菌染色方法

細(xì)菌涂片及細(xì)菌染色是微生物學(xué)的基本技術(shù)，也是觀(guān)察細(xì)菌最簡(jiǎn)單且行之有效的方法，是微生物檢測(cè)人員常用技能之一。通常情況下，由于細(xì)菌個(gè)體較小，較透明或半透明，如未經(jīng)染色往往不以觀(guān)察識(shí)別。因此借助于染色法可以使細(xì)菌著色，與視野背景形成鮮明對(duì)比，從而易于在顯微鏡下進(jìn)行觀(guān)察。

微生物檢測(cè)常見(jiàn)的細(xì)菌染色方法包括簡(jiǎn)單染色、負(fù)染色、革蘭氏染色、芽孢染色法、鞭毛染色、莢膜染色、死活染色。制備細(xì)菌染色片一般要經(jīng)過(guò)涂片、固定、染色、水洗、干燥等步驟，然后用顯微鏡甚至油鏡觀(guān)察。

1. 簡(jiǎn)單染色：

在實(shí)驗(yàn)室微生物檢測(cè)過(guò)程中，不同細(xì)菌或者由于觀(guān)察者所側(cè)重觀(guān)察的內(nèi)容不同，所以使用的染料也有差異，但是簡(jiǎn)單細(xì)菌染色的方法是一樣的。

先按照上述的制片方法制片，制成需要觀(guān)察的玻片后，使用相對(duì)應(yīng)的染料滴加到玻片上的菌膜區(qū)域，以覆蓋菌膜為準(zhǔn)。按照不同染料的要求，結(jié)合所觀(guān)察的內(nèi)容確定染色時(shí)間，染色時(shí)間到達(dá)時(shí)，進(jìn)行水洗，干燥等步驟。最后得到的玻片加蓋蓋玻片即可進(jìn)行鏡檢。如有需要可以后續(xù)再進(jìn)行油封、蠟封等封片過(guò)程。簡(jiǎn)單細(xì)菌染色過(guò)程如下圖：

2. 負(fù)染色

制備觀(guān)察圖片是非常容易的，但是對(duì)微生物檢測(cè)初學(xué)者來(lái)說(shuō)想要在玻片中找到目標(biāo)菌還是有一定難度的，因?yàn)榧?xì)菌常常無(wú)色透明且比較小，所以對(duì)初學(xué)者來(lái)說(shuō)除非對(duì)光圈等進(jìn)行很精細(xì)的調(diào)節(jié)，否則很難觀(guān)察到目標(biāo)菌，因此進(jìn)行負(fù)染色就十分重要。該方法是將微生物與苯胺黑或者india墨水混合，再將混合物覆蓋于載玻片表面，由于這兩種天然黑色染料不能滲入微生物細(xì)胞，所以使得透明的微生物個(gè)體在黑色的背景下很容易觀(guān)察。負(fù)染色法常見(jiàn)有兩種操作方法。

第一種發(fā)個(gè)方法比較常見(jiàn)，在一個(gè)載玻片上將微生物與異地苯胺黑混合，用另外的載玻片將混合物均勻的覆蓋于原來(lái)的載玻片上。該方法的目的是使混合物在在玻片上一邊厚一邊薄，在厚與薄中間的額區(qū)域就是最佳觀(guān)察區(qū)域。如圖所示：

第二種方法是用一接種環(huán)苯胺黑與微生物混合，用接種針在載玻片的中央將混合物延伸很小的區(qū)域。具體操作如圖所示：

3. 革蘭氏染色

革蘭氏染色是微生物檢測(cè)細(xì)菌學(xué)中廣泛使用的一種鑒別染色法。細(xì)菌先經(jīng)堿性染料結(jié)晶紫染色，而后經(jīng)碘液進(jìn)行媒染，之后用酒精脫色，在一定條件下有的細(xì)菌媒染后的顏色不會(huì)脫去，有的可以被脫去，前者叫做革蘭氏陽(yáng)性菌，后者為革蘭氏陰性菌。為方便進(jìn)一步觀(guān)察，脫色后再用堿性蕃紅進(jìn)行復(fù)染，陽(yáng)性菌仍為紫色，陰性菌染成紅色，這就是革蘭氏染色的原理。其步驟包括初染、媒染、脫色、復(fù)染四個(gè)步驟，主要步驟如圖所示：

4. 芽孢染色法

部分細(xì)菌能產(chǎn)生內(nèi)孢子，這些孢子能抵制細(xì)菌染色液的進(jìn)入，在微生物檢測(cè)革蘭氏染色法涂片染色時(shí)，革蘭氏陽(yáng)性菌的芽孢呈現(xiàn)無(wú)色。雖然芽孢在革蘭氏染色片中可以看到，但在不易清晰觀(guān)察時(shí)，可用特殊的芽孢染色法，使芽孢與菌體呈現(xiàn)不同顏色，便于觀(guān)察。主要的芽孢染色法有孔雀綠染色法和石碳酸復(fù)紅染色法。

孔雀綠染色法的具體步驟：首先將生有芽孢的斜面菌苔按革蘭氏染色法涂片后，用飽和孔雀綠水溶液染色10min，然后用自來(lái)水沖洗，沖洗完后用0.5%蕃紅液復(fù)染30s，用水洗，吸干，即可鏡檢，鏡檢時(shí)芽孢呈綠色，菌體和芽孢囊呈微紅色。

石碳酸蕃紅染色法具體步驟：首先按常規(guī)涂片，然后滴加石碳酸復(fù)紅于涂片上，并于玻片下緩緩加熱，使染液冒蒸汽但不沸騰，并繼續(xù)滴加染液，不使涂片上染液蒸干，這樣保持5min。帶涂片冷卻后，傾去染液，用酸性乙醇脫色指無(wú)紅色染劑洗脫為止，接著徹底水洗，洗后用呂氏美藍(lán)復(fù)染2-3min，水洗吸干后即可進(jìn)行鏡檢，鏡檢時(shí)菌體計(jì)孢囊呈藍(lán)色，芽孢呈紅色。

5. 鞭毛染色法

鞭毛是細(xì)菌的運(yùn)動(dòng)器官，非常纖細(xì)，超出了光學(xué)顯微鏡觀(guān)察極限，因此通常情況下在顯微鏡下觀(guān)察不到。通過(guò)特殊的染色技術(shù)，可以將染色液附加到鞭毛的周?chē)黾铀闹睆?，從而能在光學(xué)顯微鏡下觀(guān)察到鞭毛。鞭毛染色一般分銀鹽法和復(fù)紅沉淀法兩種。

這里介紹一下銀鹽沉淀法。用作鞭毛染色的載玻片必須是絕對(duì)干凈無(wú)油脂的，將載玻片在火焰上快速灼燒5s，放在染色架上冷卻，用蠟筆分成兩個(gè)區(qū)域，然后用移液管或者巴斯德移液管吸取2mL無(wú)菌水加入到幼齡生長(zhǎng)活躍的斜面菌株中，慢慢震蕩并旋轉(zhuǎn)試管使菌株懸浮，盡量避免使用接種環(huán)，將懸液轉(zhuǎn)移到干凈的試管中，通過(guò)懸滴試驗(yàn)檢查菌體的運(yùn)動(dòng)型，用無(wú)菌水將懸浮液稀釋至略有渾濁為止，放入20-30℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)30min，然后移取一滿(mǎn)環(huán)懸浮液加在已冷卻的載玻片一端，傾斜載玻片讓液滴流到蠟筆畫(huà)的中心線(xiàn)，在空氣中自然干燥。然后用媒染色劑媒染5min之后，慢慢用蒸餾水充分漂洗掉所有的媒染液，用熱的Fontana銀鹽覆蓋，染色5min，每隔1min更換一次染色液（Fontana銀液在沸水浴中加熱），細(xì)菌涂層的每一部分都要浸在染色液中，不能裸露。最有用水沖洗，自然晾干即可進(jìn)行鏡檢。應(yīng)當(dāng)注意一點(diǎn)，染色法的燃料須當(dāng)日配制，4h內(nèi)使用，最好是現(xiàn)配現(xiàn)用。

6. 莢膜染色

一般細(xì)菌的莢膜與染色劑的親和性低，但莢膜通透性高，因此染料可以透過(guò)莢膜使菌體著色。一般采用負(fù)染色方法使背景和菌體之間形成一透明區(qū)，將菌體襯托出來(lái)便于觀(guān)察分辨。

莢膜染色的步驟：加一滴6%葡萄糖水溶液在載玻片的一端，無(wú)菌操作，挑取細(xì)菌斜面上培養(yǎng)72h左右的膠質(zhì)芽孢桿菌與其混合，加1滴墨汁充分混勻，用推片法制片將菌液鋪成薄層，自然干燥，滴加1-2滴無(wú)水乙醇覆蓋涂片，固定1min，自然干燥，在已晾干的涂面上，滴加1%結(jié)晶紫染色液染色，2min后用20%的硫酸銅沖洗數(shù)次，再用自來(lái)水沖洗一次，使用擦鏡紙擦干后即可鏡檢。有莢膜的菌菌體呈紫色，背景灰黑色，莢膜不著色呈無(wú)色透明圈。具體操作過(guò)程見(jiàn)下圖：

7. 死活染色

細(xì)菌死活染色排除法是生物研究中判斷細(xì)胞活性的一種常用方法，是利用死活細(xì)胞在生理機(jī)能和性質(zhì)上的差異來(lái)進(jìn)行的，常用的染色劑有臺(tái)盼藍(lán)和美藍(lán)，前者使用范圍較廣，后者一般在酵母菌細(xì)胞死活鑒定上使用較多。

以上介紹的細(xì)菌染色法，基本上涵蓋傳統(tǒng)微生物實(shí)驗(yàn)室能用到的所有的細(xì)菌染色法。染色法在細(xì)菌的觀(guān)察、分類(lèi)、鑒定中經(jīng)常用到，因此是微生物檢測(cè)人員不可或缺的基本技能之一。