濃香型大曲貯存期微生物群落演替及代謝產(chǎn)物的變化機制

大曲作為糖化發(fā)酵劑，為白酒釀造提供了重要且豐富的菌系、酶系和物系，即為后續(xù)窖內(nèi)酒醅發(fā)酵提供微生物，將原料降解成小分子物質(zhì)的水解酶或催化酯類物質(zhì)合成的酯化酶，以及白酒風味物質(zhì)或其前體物。大曲生產(chǎn)過程通常包括1 個月左右的主發(fā)酵期和2～6 個月左右的貯存期。近年來，關于大曲主發(fā)酵期間微生物群落及功能變化機制的研究非常活躍，而貯存期大曲微生物群落結構、酶系以及風味物質(zhì)變化也越來越受到關注。總之，現(xiàn)有研究顯示貯存過程對大曲質(zhì)量具有重要影響，但關于貯存期大曲微生物群落結構及代謝產(chǎn)物變化機制的研究鮮有報道。

四川輕化工大學生物工程學院的徐千惠，羅惠波，黃丹*等通過高通量測序解析濃香型大曲的曲心和曲皮在貯存期間發(fā)生的微生物群落結構變化，并分析糖化酶、液化酶活力的變化，利用HS-SPME-GC-MS研究揮發(fā)性代謝產(chǎn)物的差異，構建零模型解析微生物群落的組裝過程，運用相關性分析探究糖化力、液化力、風味物質(zhì)與大曲微生物之間的聯(lián)系，揭示濃香型大曲貯存期菌系、酶系以及物系的變化機制，為優(yōu)化大曲貯存工藝、提高大曲質(zhì)量提供理論依據(jù)。

1 濃香型大曲貯存過程中微生物群落結構變化

1.1 濃香型大曲貯存過程中優(yōu)勢微生物群落演替特征

大曲微生物在持續(xù)進行的貯存過程中此消彼長，采用高通量測序技術對其演替情況進行解析。在大曲貯存期間共注釋到16 個細菌門和4 個真菌門，212 個細菌屬和30 個真菌屬，其中將平均相對豐度前10的優(yōu)勢微生物屬變化情況繪制成柱形圖展示。由圖1a可知，曲皮在入庫貯存第0天的主要優(yōu)勢細菌是芽孢桿菌屬（

Bacillus

Pseudomonas

Weissella

Streptococcus

Actinomyces

Kroppenstedtia

Thermoactinomyces

Staphylococcus

Lactobacillus

Enterococcus

Thermoascus

Aspergillus

Pichia

總體看來，大曲貯存過程使曲皮中的魏斯氏菌屬、乳桿菌屬、畢赤酵母屬和曲心中的高溫放線菌屬、魏斯氏菌屬、乳桿菌屬、鏈球菌屬、曲霉屬的相對豐度得到了極大提高，同時使曲皮和曲心中的芽孢桿菌屬、假單胞菌屬、嗜熱子囊菌屬等的相對豐度下降。此外，曲皮中others的變化情況顯示了大曲中一些原本的極低豐度微生物可能由于適應曲庫的環(huán)境條件以及微生物之間友好的相互關系而大量生長，同時一些微生物因為適應性差而走向衰竭。這些結果都表明貯存使大曲微生物間相互作用重新平衡，改變了微生物群落組成。

1.2 濃香型大曲貯存過程中菌群結構特征的變化

不同貯存時間的大曲微生物

為探究大曲貯存過程中微生物群落結構的變化，對大曲樣品進行PCoA。由圖3a可知，PC1和PC2對細菌群落組成差異的解釋度分別為29.63%和22.15%，共計51.78%。貯存前43 d的曲心細菌結構相近，但曲皮細菌樣本相互分離較遠，說明貯存前43 d內(nèi)曲皮細菌結構發(fā)生了明顯變化。貯存第108、161天曲心和曲皮的細菌樣本各自聚在一起，表明大曲貯存3 個月后，細菌結構已經(jīng)趨于穩(wěn)定，這與以往的研究一致。如圖3b所示，PC1和PC2對真菌群落組成差異的解釋度分別為53.02%和41.79%，總解釋度高達94.81%。曲心的真菌結構總體距離相近，說明曲心真菌結構在貯存過程中變化不大，并且與貯存第0、43、161天的曲皮真菌結構相似性較高，但分別與曲皮在第9、108天的真菌結構相差甚遠。為進一步了解大曲貯存期間微生物群落結構，Venn圖展示了不同貯存時期間的共有微生物及特有微生物數(shù)量。如圖4所示，在屬水平上，曲皮、曲心在5 個貯存時期分別有13、14 個共有物種，其中絕大部分如曲霉屬、芽孢桿菌屬、乳桿菌屬、畢赤酵母屬、魏斯氏菌屬等都屬于圖1中的優(yōu)勢菌屬，但它們在貯存不同時期的相對豐度各不相同。曲皮和曲心在每個貯存時期的特有物種數(shù)量總和分別占53%和50%，表明大曲貯存過程中的微生物差異由一半的共有物種的豐度差異和一半的特有物種的物種差異組成。這些結果同樣表明一些原本的極低豐度微生物可能會隨著貯存的進行大量生長，同時一些微生物豐度降至極低，也有研究顯示部分特有低豐度微生物來自貯存環(huán)境。

2 濃香型大曲貯存過程中糖化力和液化力的變化

糖化酶是微生物代謝產(chǎn)生的重要酶類，能將釀酒原料中的淀粉、纖維素等多糖降解為還原糖，再由酵母等微生物進一步轉化為乙醇，因此糖化力是大曲重要的生化指標。由圖5a可知，曲皮糖化力在貯存前108 d先上升后下降（272、398、107 mg/（g·h）），在貯存第108～161天內(nèi)大幅回升（107～256 mg/（g·h））。而曲心糖化力在48～187 mg/（g·h）之間呈現(xiàn)比較規(guī)律的波動。液化酶能斷裂淀粉分子的

3 濃香型大曲貯存過程中揮發(fā)性代謝產(chǎn)物的變化

大曲中的風味物質(zhì)可以作為酒體中香氣物質(zhì)的直接來源，也可作為酒中香氣物質(zhì)的重要前驅物來源。采用HS-SPME-GC-MS分別在貯存過程的曲心和曲皮位置檢測到67、70 種揮發(fā)性化合物，可分為醇類、酯類、酚類、酸類、醛酮類、烷烯類、吡嗪類和其他物質(zhì)。由圖6可知，曲皮中風味物質(zhì)的總含量隨著貯存時間呈現(xiàn)先下降后上升再下降的變化趨勢，其中在貯存約3 個月時總含量達到最高，這在其他報道中也有同樣的發(fā)現(xiàn)，相比之下，曲心中的風味物質(zhì)含量總體較為穩(wěn)定，僅在貯存結束時發(fā)生了較大的下降。酯類物質(zhì)是中國白酒中令人愉悅的水果、花香、蜂蜜香氣的主要貢獻者，是貯存期間占比最大的揮發(fā)性風味物質(zhì)，令人注意的是其在曲皮貯存第108天時發(fā)生了激增，與前述微生物群落演替結果相結合，推測這種變化可能與魏斯氏菌和畢赤酵母的劇烈增加有關。據(jù)報道，魏斯氏菌發(fā)酵產(chǎn)生乳酸，為乳酸乙酯的合成提供前體物質(zhì)，畢赤酵母能利用蔗糖和葡萄糖制造乙酸乙酯等芳香化合物，二者均在酯化過程中發(fā)揮重要作用。醇作為酸和酯的重要前體物質(zhì)，其含量僅次于酯類，在貯存期間變化幅度不大。酸類、烷烯類、醛酮類物質(zhì)的變化比較一致，表現(xiàn)為貯存初期有較高的含量，之后迅速下降，并在之后的貯存期間保持非常低的含量。總體上，貯存過程使風味物質(zhì)總含量減少，這與Zhang Yuandi等的研究結果一致。其中醇類物質(zhì)、酯類物質(zhì)略微降低，酸類物質(zhì)、烷烯類物質(zhì)、醛酮類物質(zhì)大量減少。結果表明隨著貯存時間的推移，一些重要的風味化合物被豐富，一些異雜味被減少或去除，同時伴隨著部分風味物質(zhì)的揮發(fā)，說明貯存過程有助于“凈化”風味、形成獨特濃郁的“大曲味”。

4 濃香型大曲貯存過程中微生物群落的演替機制

為探究大曲貯存過程中微生物群落結構的變化原因，采用系統(tǒng)發(fā)育零模型計算大曲微生物群落的βNTI來判斷群落的構建過程。如圖7a所示，曲皮細菌群落的βNTI值在－1.12～5.05之間變化，曲心細菌在－1.28～5.55之間變化，二者的|βNTI|＞2的占比均為40%，說明細菌群落的組裝過程主要受60%的隨機性過程影響，同時受40%的確定性過程影響。曲皮真菌群落的βNTI值在－0.64～3.61之間波動，其|βNTI|＞2的比例為20%，說明曲皮真菌群落受隨機性過程主導（80%）。而曲心真菌僅在－1.52～1.76之間波動，說明其完全受隨機性過程影響（100%）。總體上，大曲貯存期間微生物群落的組裝主要由隨機性過程主導。相較于真菌來說，細菌受確定性過程的影響更大；相較于曲心微生物來說，曲皮微生物受確定性過程的影響更大。

為了進一步量化隨機性和確定性過程在貯存期大曲微生物群落構建中的貢獻程度，圖7b顯示了群落的修正RCbray。結果表明無論是曲皮還是曲心，對細菌群落構建的影響因素包括40%的變量選擇（環(huán)境因子、微生物相互作用等）、40%的擴散限制以及20%的未定義過程（生態(tài)漂變等）。而真菌群落則大部分受未定義過程的影響（曲皮70%、曲心90%），說明主要由生態(tài)漂變等導致真菌結構發(fā)生隨機變化。變量選擇對曲皮真菌群落構建的貢獻為30%，但對曲心真菌的貢獻為0。勻質(zhì)擴散只在曲心真菌群落構建過程中發(fā)揮了一定作用（10%），這種生態(tài)過程會導致群落結構的相似性。而對于細菌群落來說，相對穩(wěn)定的貯存環(huán)境可能導致擴散限制較大地影響了細菌在曲庫中的擴散。有研究表明，真菌群落在曲心中傾向于隨機分散，而細菌群落則偏好聚集狀態(tài)。結果表明，變量選擇對微生物菌群（尤其是曲皮中）發(fā)揮較大的作用，說明貯存條件的改變及微生物間的相互作用對群落演替十分重要。而目前的生產(chǎn)中，貯存期間幾乎都未采取人工調(diào)控溫濕度等措施，使氣候條件成了重要因素，可見在大曲貯存期實施工藝調(diào)控對穩(wěn)定大曲質(zhì)量具有重要意義。

大曲貯存過程中微生物的生態(tài)位寬度如圖8所示。曲心細菌和曲皮真菌在貯存第108天和曲皮細菌在貯存第43天時的生態(tài)位寬度發(fā)生激增，說明這時候微生物對環(huán)境資源的利用程度大大增加，這一時期的變化與圖1中優(yōu)勢菌群結構發(fā)生劇烈演替相符合。對比貯存前后的生態(tài)位寬度，結果顯示除了曲皮細菌外，其余菌群的生態(tài)位寬度經(jīng)貯存后都增加，說明貯存使大曲微生物對環(huán)境資源的利用增加，對微生物間相互作用的適應狀況更好。貯存過程中不同時期的大曲微生物占據(jù)著不同的生態(tài)位，顯示了對環(huán)境擾動的不同響應，這種響應是由其生理耐受性、擴散能力、分類多樣性和功能多樣性等共同介導，因此貯存期大曲微生物群落不同的組裝過程可能是受到微生物群對環(huán)境干擾的不同響應和生態(tài)位寬度的差異所影響。此結果與零模型的分析結果一致反映了貯存環(huán)境對大曲微生物生長代謝的重要性。

5 濃香型大曲貯存過程中重要酶活力與微生物群落演替的相關性

貯存期間大曲微生物群落不斷變化，并通過代謝活動引起酶活力的變化。通過RDA探究兩種重要酶活力與大曲微生物間的關聯(lián)，其中RDA1和RDA2（加權）標準正交物種得分大于0.09的菌屬見圖9。如圖9a所示，曲皮中，糖化力與嗜熱子囊菌屬呈負相關，與畢赤酵母屬、魏斯氏菌屬、乳桿菌屬、芽孢桿菌屬和曲霉屬呈正相關。貯存第108天和第161天的曲皮樣本與液化力極為相關，其中屬畢赤酵母屬、魏斯氏菌屬、乳桿菌屬貢獻最大。由圖9b可知，曲心中的糖化力和液化力均與科薩克氏菌屬（

Kosakonia

Thermomyces

6 濃香型大曲貯存過程中揮發(fā)性風味物質(zhì)與微生物群落演替的相關性

為探究大曲貯存期間揮發(fā)性風味物質(zhì)的變化機制，利用Spearman相關性分析評估揮發(fā)性化合物與微生物的關聯(lián)。如圖10a所示，曲皮中一些酯類物質(zhì)如9-十六碳烯酸乙酯、肉豆蔻酸乙酯、十六酸乙酯、十八烯酸乙酯與根霉屬（

Rhizopus

Wickerhamomyces

Flavobacterium

Alternaria

Corynebacterium

Fusobacterium

Acetobacter

Streptomyces

Exiguobacterium

Brachybacterium

Thermobacillus

Klebsiella

Thermus

Crossiella

結論

本研究利用高通量測序探究濃香型大曲貯存過程中的微生物群落組成及結構特征。結果顯示大曲的貯存過程是微生物進一步相互作用并重新平衡群落結構的過程，長時間的貯存改變了功能微生物比例，最終導致微生物多樣性增加、群落結構趨于穩(wěn)定、均勻。貯存結束后，成熟大曲的曲心微生物群落主要由芽孢桿菌屬、魏斯氏菌屬、高溫放線菌屬、克羅彭斯特菌屬、乳桿菌屬、嗜熱子囊菌屬、曲霉屬等組成；曲皮微生物主要包括魏斯氏菌屬、乳桿菌、高溫放線菌屬、嗜熱子囊菌屬、畢赤酵母屬等優(yōu)勢微生物。此外研究了糖化力、液化力以及揮發(fā)性風味物質(zhì)的變化規(guī)律，發(fā)現(xiàn)貯存過程使曲皮中糖化力、液化力有所下降，但在曲心中有所增加，同時有助于風味物質(zhì)的豐富和轉化，這些變化使曲香更加濃郁。通過構建零模型探索微生物群落的組裝機制，發(fā)現(xiàn)隨機性過程主導了群落結構的變化，同時確定性過程也有重要影響，其中變量選擇發(fā)揮了較大的作用，生態(tài)位差異也有一定影響，這一結論還需更多的研究驗證。多元統(tǒng)計分析顯示微生物區(qū)系與大曲糖化力、液化力及揮發(fā)性代謝產(chǎn)物之間有顯著相關性，說明貯存有助于通過改變微生物群落生產(chǎn)出高質(zhì)量大曲。

總之，貯存過程對大曲微生物群落結構的重新平衡、酶活力及揮發(fā)性代謝產(chǎn)物的積累與轉化具有重要意義，這與Fan Guangsen等的研究結果一致。引起這些變化的確定性過程是變量選擇，說明大曲貯存期實施工藝調(diào)控對穩(wěn)定大曲質(zhì)量非常重要。此外，還應對微生物的代謝通路進行分析，進一步完善貯存期間大曲品質(zhì)的變化機制。本研究對優(yōu)化大曲的貯存工藝、提高大曲品質(zhì)具有重要意義。

本文《濃香型大曲貯存期微生物群落演替及代謝產(chǎn)物的變化機制》來源于《食品科學》2023年44卷第22期225-234頁，作者徐千惠，饒家權，鄒永芳，張 明，羅惠波，黃 丹。