制曲方式對(duì)豉香型白酒酒曲理化因子及細(xì)菌群落的影響

中國(guó)白酒類型繁多，可根據(jù)地域、發(fā)酵材料、釀造工藝、所用酒曲及酒體風(fēng)味進(jìn)行區(qū)分。豉香型白酒在1984年被確立，是珠三角地區(qū)所特有的傳統(tǒng)白酒，因其具有獨(dú)特的豉香味而得名，其復(fù)雜的釀造過(guò)程可大致分為制曲、投罐發(fā)酵、蒸餾、陳肉醞浸等，其中制曲是釀造過(guò)程中最關(guān)鍵的環(huán)節(jié)之一，酒曲的質(zhì)量直接決定了豉香型白酒的產(chǎn)量和品質(zhì)。 傳統(tǒng)酒曲易受環(huán)境因素影響，導(dǎo)致酒曲質(zhì)量難以穩(wěn)定，因此近年來(lái)豉香型白酒酒曲的制作開始引進(jìn)機(jī)械化制曲技術(shù)，機(jī)械制曲工藝如圖1所示。

目前已對(duì)豉香型白酒傳統(tǒng)制曲過(guò)程中的細(xì)菌群落進(jìn)行研究，但機(jī)械制曲和傳統(tǒng)制曲過(guò)程細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的差異尚不清晰，因此，仲愷農(nóng)業(yè)工程學(xué)院輕工食品學(xué)院的王宇良、李志溥、趙文紅*等人通過(guò)分析表征酒曲品質(zhì)的理化因子，同時(shí)采用高通量對(duì)機(jī)械制曲和傳統(tǒng)制曲過(guò)程中細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行解析，并結(jié)合相關(guān)性分析菌群和理化因子間的作用關(guān)系，對(duì)推動(dòng)豉香型白酒機(jī)械化制曲的創(chuàng)新和應(yīng)用具有重要意義。

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制曲方式對(duì)酒曲理化因子的影響

1.1 制曲過(guò)程中水分的變化

水分是衡量曲是否達(dá)到儲(chǔ)藏標(biāo)準(zhǔn)的一個(gè)主要指標(biāo)，一般來(lái)說(shuō)水分質(zhì)量分?jǐn)?shù)小于13%為宜。如圖2所示，在整個(gè)制曲過(guò)程中，傳統(tǒng)制曲和機(jī)械制曲中水分含量均隨時(shí)間延長(zhǎng)緩慢降低，其中傳統(tǒng)制曲最高水分質(zhì)量分?jǐn)?shù)由初始的（40.78±1.82）%降低至干燥結(jié)束時(shí)的（10.32±0.10）%，而機(jī)械制曲則由初始最高水分質(zhì)量分?jǐn)?shù)（33.65±1.74）%降低至干燥結(jié)束時(shí)的（7.35±0.17）%。機(jī)械制曲全程均在封閉的圓盤制曲儀中，在制曲過(guò)程的前4 d為機(jī)械控水，使得其水分含量呈階梯式下降趨勢(shì)。而兩者就質(zhì)地而言，傳統(tǒng)制曲為整塊狀，機(jī)械制曲為松散狀，因此傳統(tǒng)制曲中水分含量會(huì)略高于機(jī)械制曲，兩者最終水分含量存在顯著差異。

1.2 制曲過(guò)程中酸度的變化

如圖3所示，在制曲過(guò)程中，傳統(tǒng)制曲的酸度在發(fā)酵初期迅速升高，由（0.22±0.01 ）mmol/10 g 上升至（0.88±0.03）mmol/10 g，在36 h后開始降低至干燥完成后酸度僅有（0.30±0.01）mmol/10 g。而機(jī)械制曲的酸度變化則呈緩慢積累過(guò)程，初始酸度為（0.38±0.01）mmol/10 g，在90 h到達(dá)峰值（0.63±0.02）mmol/10 g，而后迅速降低至（0.40±0.01）mmol/10 g，到最后干燥完成時(shí)酸度為（0.463±0.01）mmol/10 g，比傳統(tǒng)制曲高0.16 mmol/10 g，存在顯著差異。

1.3 制曲過(guò)程中氨基酸態(tài)氮的變化

由圖4可知，傳統(tǒng)制曲和機(jī)械制曲的初始氨基酸態(tài)氮含量分別為（125.59±11.71）mg/g和（104.65±4.81）mg/g，均在制曲42 h到達(dá)峰值，分別為（384.29±27.76）mg/g和（312.27±3.58）mg/g，制曲結(jié)束時(shí)傳統(tǒng)制曲中氨基酸態(tài)氮顯著高于機(jī)械制曲，含量分別為（311.31±10.25）mg/g和（233.00±10.12）mg/g。

1.4 制曲過(guò)程中發(fā)酵力的變化

影響發(fā)酵力的主要微生物是釀酒酵母，釀酒酵母在無(wú)氧條件將原料中的糖類物質(zhì)分解產(chǎn)生醇類物質(zhì)以及二氧化碳。由圖5可知，傳統(tǒng)制曲和機(jī)械制曲的初始發(fā)酵力分別為（1.328±0.09）U和（1.348±0.14）U，傳統(tǒng)制曲在78 h達(dá)到峰值（5.067±0.341）U，機(jī)械制曲則在36 h達(dá)到峰值（4.605±0.145）U，制曲結(jié)束時(shí)傳統(tǒng)制曲發(fā)酵力顯著高于機(jī)械制曲，分別為（4.532±0.039）U和（3.220±0.094）U。

1.5 制曲過(guò)程中酯化力的變化

由圖6可知，傳統(tǒng)制曲和機(jī)械制曲的初始酯化力分別為（211±26.98）mg/（g·100 h）和（184.66±6.66）mg/（g·100 h），傳制曲在30 h達(dá)到峰值（547.66±12.76）mg/（g·100 h），機(jī)械制曲則在36 h達(dá)到峰值（511.66±23.01）mg/（g·100 h），制曲結(jié)束時(shí)傳統(tǒng)制曲發(fā)酵力顯著高于機(jī)械制曲，分別為（498±26.28）mg/（g·100 h）和（433.65±34.25）mg/（g·100 h）。

1.6 制曲過(guò)程中液化力的變化

由圖7可知，傳統(tǒng)制曲的液化力由培養(yǎng)初始的（0.276±0.02）g/（g·h）至72 h達(dá)到峰值（3.521±0.12）g/（g·h），隨后呈波動(dòng)變化趨勢(shì)，制曲結(jié)束時(shí)其液化力為（1.95±0.08）g/（g·h）；機(jī)械制曲則由發(fā)酵初始（0.60±0.04）g/（g·h）至30 h達(dá)到峰值（4.04±0.135）g/（g·h），制曲結(jié)束時(shí)其液化力為（1.88±0.095）g/（g·h）。兩者液化力動(dòng)態(tài)變化趨勢(shì)相似，干燥期結(jié)束后液化力無(wú) 顯著差異（P＞0.05）。

1.7 制曲過(guò)程中糖化力的變化

糖化力是衡量酒曲是否合格的一項(xiàng)重要指標(biāo)。由圖8可知，傳統(tǒng)制曲和機(jī)械制曲的初始酯化力分別為（139.92±12.06）mg/（g·h）和（168.33±9.03）mg/（g·h），傳統(tǒng)制曲在72 h達(dá)到峰值（565.66±15.10）mg/（g·h），機(jī)械制曲則在84 h達(dá)到峰值（353.78±4.14）mg/（g·h），制曲結(jié)束時(shí)傳統(tǒng)制曲的糖化力顯著高于機(jī)械制曲，分別為（455.96±23.16）mg/（g·h）和（233.36±19.17）mg/（g·h）。

1.8 制曲過(guò)程中酸性蛋白酶活力的變化

由圖9可知，傳統(tǒng)制曲和機(jī)械制曲的初始酸性蛋白酶活力分別為（33.08±2.58）U/g和（21.68±1.23）U/g，傳統(tǒng)制曲在60 h達(dá)到峰值（66.91±1.67）U/g，機(jī)械制曲則在39～51 U/g之間浮動(dòng)，制曲結(jié)束時(shí)傳統(tǒng)制曲與機(jī)械制曲之間無(wú)顯著差異，分別為（51.85±4.95）U/g和（40.71±4.03）U/g。

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傳統(tǒng)制曲與機(jī)械制曲過(guò)程中細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)分析

傳統(tǒng)和機(jī)械制曲過(guò)程中共鑒定出18 種（相對(duì)豐度大于1%）屬水平微生物群落（圖10），包括乳桿菌屬（Lactobacillus）、芽孢桿菌屬（Bacillus）、片球菌屬（Pediococcus）、魏氏菌屬（Weissella）、青枯菌屬（Ralstonia）、明串珠菌屬（Leuconostoc）、醋酸桿菌屬（Acetobacter）、微小桿菌屬（Exiguobacterium）、葡萄球菌屬（Staphylococcus）、庫(kù)特氏菌屬（Kurthia）、不動(dòng)桿菌屬（Acinetobacter）、腸球菌屬（Enterococcus）、葡萄糖酸桿菌屬（Glutamicibacter）、裂孢菌屬（Thermobifida）、鏈霉菌屬（Streptomyces）、腸桿菌屬（Enterobacter）、芽殖桿菌屬（Gemmobacter）、海洋芽孢桿菌屬（Oceanobacillus），其中傳統(tǒng)和機(jī)械制曲中的核心細(xì)菌屬均為L(zhǎng)actobacillus、Bacillus、Pediococcus和Weissella，分別占兩組總菌落數(shù)的80%以上。通過(guò)對(duì)比發(fā)現(xiàn)，兩組中Lactobacillus、Bacillus、Pediococcus和Weissella有明顯差異，機(jī)械制曲結(jié)束時(shí)的優(yōu)勢(shì)細(xì)菌屬為Bacillus（71.20%），傳統(tǒng)制曲中Bacillus的相對(duì)含量?jī)H為0.38%；傳統(tǒng)制曲結(jié)束時(shí)的主要優(yōu)勢(shì)細(xì)菌屬為L(zhǎng)actobacillus（68.30%），而機(jī)械制曲中Lactobacillus的相對(duì)含量?jī)H為9.71%，同時(shí)Pediococcus和Weissella在機(jī)械制曲中的含量明顯低于傳統(tǒng)制曲，其中在制曲結(jié)束時(shí)，Pediococcus在傳統(tǒng)制曲和機(jī)械制曲中的含量分別為17.10%和2.20%，Weissella為7.70%和0.28%。

Lactobacillus

Bacillus

Bacillus

Bacillus

Lactobacillus

Weissella

Lactobacillus

Weissella

Bacillus

Bacillus

Bacillus

Bacillus

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機(jī)械制曲主要優(yōu)勢(shì)細(xì)菌間及理化因子的相關(guān)性分析

為揭示細(xì)菌群落間的競(jìng)爭(zhēng)關(guān)系以及對(duì)理化因子的影響，選取機(jī)械制曲過(guò)程中的核心且與傳統(tǒng)制曲存在顯著差異的細(xì)菌屬與理化因子進(jìn)行相關(guān)性分析，如圖11所示，發(fā)現(xiàn)Bacillus與Lactobacillus、Pediococcus和Weissella間存在競(jìng)爭(zhēng)關(guān)系，由于機(jī)械制曲和傳統(tǒng)制曲的質(zhì)地及生產(chǎn)環(huán)境不同，使得兩者雖主要核心菌屬相同，但核心菌種間的組成比例不同，機(jī)械制曲過(guò)程中的環(huán)境適宜Bacillus的生長(zhǎng)，其大量繁殖從而導(dǎo)致Lactobacillus、Pediococcus和Weissella的生長(zhǎng)受到抑制，同時(shí)在傳統(tǒng)制曲中， 較高豐富度的 Lactobacillus 可能會(huì)合成抗生素和細(xì)菌素，導(dǎo)致傳統(tǒng)制曲中 Bacillus 的生長(zhǎng)受到抑制，

該結(jié)果 表明機(jī)械制曲過(guò)程要合理科學(xué)控制干燥時(shí)進(jìn)風(fēng)量及散曲攪拌頻率，將制曲過(guò)程中的氧氣含量控制在合理范圍內(nèi)，使得優(yōu)勢(shì)菌群結(jié)構(gòu)處于相對(duì)平衡狀態(tài)。此外 Lactobacillus 與氨基酸態(tài)氮、發(fā)酵力、酯化力、糖化力和酸性蛋白酶呈正相關(guān)； Bacillus 與酸度、氨基酸態(tài)氮和液化力呈正相關(guān)； Pediococcus 、 Weissella 與氨基酸態(tài)氮、發(fā)酵力、酯化力、液化力和 酸性蛋白酶呈負(fù)相關(guān)與酸度呈正相關(guān)。以上結(jié)果表明，機(jī)械制曲過(guò)程保持一個(gè)相對(duì)合適的氧氣含量環(huán)境和相對(duì)穩(wěn)定環(huán)境變化，既有利于Lactobacillus、Bacillus、Weissella等核心功能微生物的平衡生長(zhǎng)，又有利于提高酒曲品質(zhì)。

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結(jié)論

通過(guò)測(cè)定豉香型白酒傳統(tǒng)和機(jī)械制曲過(guò)程中水分、酸度、氨基酸態(tài)氮、發(fā)酵力、酯化力、液化力、糖化力、酸性蛋白酶發(fā)現(xiàn)，在制曲結(jié)束時(shí)，傳統(tǒng)制曲的水分、氨基酸態(tài)氮、發(fā)酵力、酯化力和糖化力顯著高于機(jī)械制曲，機(jī)械制曲的酸度高于傳統(tǒng)制曲；兩者液化力、酸性蛋白酶活力分別穩(wěn)定在40～50 U/g和1.8 g/（g·h）左右，無(wú)顯著差異。采用高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)豉香型白酒傳統(tǒng)和機(jī)械制曲過(guò)程中的細(xì)菌群落進(jìn)行鑒定發(fā)現(xiàn)，兩者制曲過(guò)程中的主要核心細(xì)菌屬雖相似，均為L(zhǎng)actobacillus、Bacillus、Pediococcus和Weissella，占兩組總菌落數(shù)的80%以上，但核心細(xì)菌屬間的占比存在顯著差異，傳統(tǒng)制曲中Lactobacillus（傳統(tǒng)制曲：68.30%；機(jī)械制曲：9.71%）、Pediococcus（傳統(tǒng)制曲：17.10%；機(jī)械制曲：2.20%）和Weissella（傳統(tǒng)制曲：7.70%；機(jī)械制曲：0.28%）顯著高于機(jī)械制曲，機(jī)械制曲中Bacillus（傳統(tǒng)制曲：0.38%；機(jī)械制曲：71.20%）顯著高于傳統(tǒng)制曲。通過(guò)核心菌屬與理化因子相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，Lactobacillus、Bacillus、Pediococcus和Weissella均與表征酒曲品質(zhì)的理化因子間存在明顯相關(guān)性，其中Lactobacillus與氨基酸態(tài)氮、發(fā)酵力、酯化力、糖化力和酸性蛋白酶呈正相關(guān)；Bacillus與酸度、氨基酸態(tài)氮和液化力呈正相關(guān)，Lactobacillus和Bacillus同時(shí)為兩種制曲方式中差異最顯著的細(xì)菌屬，由于機(jī)械制曲過(guò)程中添加了麥麩及制曲環(huán)境的不同，使得其與傳統(tǒng)制曲的質(zhì)地及制曲過(guò)程中與氧氣的接觸量有所差異，如若能在機(jī)械制曲過(guò)程中合理科學(xué)地控制制曲環(huán)境中氧氣含量以及保持環(huán)境變化的相對(duì)穩(wěn)定，這樣既有利于好氧及厭氧核心功能微生物的平衡生長(zhǎng)，又有利于提高酒曲品質(zhì)。機(jī)械制曲相較于傳統(tǒng)制曲，不僅有較高的生產(chǎn)效率和較低生產(chǎn)成本，還能夠有效提高制曲環(huán)境的質(zhì)量，此外，豉香型白酒酒曲中除細(xì)菌微生物群落外，還含有豐富的真菌微生物群落，真菌同樣對(duì)發(fā)酵力、酯化力和液化力等表征指標(biāo)有著重要影響作用，細(xì)菌和真菌間的協(xié)同發(fā)酵作用最終決定了酒曲品質(zhì)，同時(shí)，機(jī)械制曲在原料中添加的麩皮可能更有利于好氧真菌的生長(zhǎng)，在后續(xù)研究中可探究其中真菌微生物群落的演替情況，同時(shí)結(jié)合細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)，以此更加全面地分析兩種制曲方式之間產(chǎn)生差異的原因。本研究通過(guò)分析對(duì)比兩種制曲方式的理化因子及細(xì)菌微生物等指標(biāo)間的差異，為豉香型白酒機(jī)械化制曲的發(fā)展及后續(xù)應(yīng)用提供一定參考意義。

本文來(lái)源于《食品科學(xué)》2023年44卷22期211-217頁(yè). 作者：王宇良，李志溥，蘇澤佳，梁景龍，白衛(wèi)東，費(fèi)永濤，趙文紅，方毅斐