斑馬魚對強(qiáng)光刺激的驚恐逃避反射試驗

驚恐反射是一種由視覺、聽覺或嗅覺誘導(dǎo)的生理反應(yīng)。正常斑馬魚在經(jīng)過一段時間的適應(yīng)后，如其所在區(qū)域中的光線、聲音或氣味等因素突然發(fā)生變化，會本能地做出一種迅速地逃脫該區(qū)域的動作。斑馬魚的驚恐反應(yīng)于68 hpf產(chǎn)生，斑馬魚的眼睛正在形成且視網(wǎng)膜神經(jīng)元突觸也正在建立，而發(fā)育至 96 hpf 后，幼年斑馬魚具有自由運(yùn)動的能力。因此，可通過對光照刺激引發(fā)的驚恐反應(yīng)能力和刺激撤除后行為恢復(fù)能力變化的觀察，檢測由視覺引發(fā)的感覺運(yùn)動高級神經(jīng)回路是否正常。

驚恐反射試驗時間為斑馬魚白天活動平臺期，在轉(zhuǎn)移至黑暗環(huán)境中適應(yīng)一段時間后，斑馬魚幼魚表現(xiàn)為靜息或平穩(wěn)游動。如果突然給予強(qiáng)光照射，正常幼魚對外界刺激的反應(yīng)表現(xiàn)迅速靜止不動或速度明顯降低。而撤除光源后，幼魚表現(xiàn)為最初表現(xiàn)為運(yùn)動活躍后又逐漸減慢。為檢測化合物暴露后幼魚對環(huán)境中光線突然變化時的反應(yīng)以及對光暗周期性交替變化的適應(yīng)能力，進(jìn)行3次光、暗交替變化，以光線變化時刻前后 1min 內(nèi)速度變化以及光、暗期內(nèi)平均移動距離等參數(shù)作為神經(jīng)行為學(xué)評價指標(biāo)。另外，應(yīng)用幼魚運(yùn)動行為儀和相關(guān)軟件的基礎(chǔ)上采用的視頻采集、圖像跟蹤技術(shù)進(jìn)行高通量的檢測。

將48孔板放入幼魚運(yùn)動行為儀內(nèi)適應(yīng)5min后，控制幼魚運(yùn)動行為儀采集幼魚運(yùn)動視頻，其中前5 min為黑暗期，第6min通過FishTrack軟件（上海欣軟）編程控制行為儀開啟底燈強(qiáng)光照射1 min后迅速關(guān)閉，5min后結(jié)束視頻采集。應(yīng)用FishTrack軟件（上海欣軟）導(dǎo)出觀察期內(nèi)每條幼魚每1min平均運(yùn)動速度和運(yùn)動距離等參數(shù)。實驗同時設(shè)正常對照。實驗時段白天為12:30~15:30，夜間18:30-20:00。通過比較光照前后不同劑量組幼魚的速度變化，以及在光照結(jié)束后恢復(fù)期內(nèi)運(yùn)動距離的變化，評價暴露對幼魚驚恐反射活動的影響，判斷幼魚的視覺或感覺運(yùn)動高級神經(jīng)回路的損傷作用。

數(shù)據(jù)分析

應(yīng)用FishTrack軟件（上海欣軟）編程實現(xiàn)間隔5min的光暗交替，導(dǎo)出每1min幼魚的平均移動速度和5min光暗期內(nèi)的總體平均移動距離等參數(shù)，通過分析光暗交替時運(yùn)動速度的變化以及在光暗周期內(nèi)運(yùn)動距離的變化，可給予藥物或化合物評是否能夠改變幼魚對驚恐刺激的反應(yīng)及適應(yīng)能力。

幼魚驚恐反射試驗反應(yīng)能力和暗適應(yīng)能力的變化（A:光暗交替時刻前后1min內(nèi)速度變化; B:光暗期內(nèi)每min移動距離）

各劑量組幼魚在暗-光交替時刻加速度的變化，呈興奮和抑制的兩種反應(yīng)效應(yīng)。例如：給予斑馬魚醋酸鉛0.01μM ~0.1μM 組隨暴露劑量增大，對突發(fā)強(qiáng)光的反應(yīng)表現(xiàn)為逐漸興奮，而 0.5μM 組的反應(yīng)同對照相似表現(xiàn)為抑制性運(yùn)動；在光-暗交替時，除 0.5μM 暴露組外幼魚運(yùn)動主要表現(xiàn)為興奮效應(yīng)，但加速度隨劑量增加逐漸降低，對暗環(huán)境的興奮性反應(yīng)降低逐漸扭轉(zhuǎn)到 0.5μM 的抑制性反應(yīng)。運(yùn)動能力比較發(fā)現(xiàn)，在光照前的暗適應(yīng)期內(nèi)幼魚的平均運(yùn)動距離呈劑量依賴性“U”型反應(yīng)，以 0.05μM 最低。在光照期內(nèi)各劑量暴露組的差別不顯著，在光照后進(jìn)入黑暗環(huán)境后整體表現(xiàn)運(yùn)動能力低于正常對照組，同樣以 0.05μM 降低最明顯。