錦鯉昏睡病(KSD)的實(shí)驗(yàn)室診斷分析

錦鯉昏睡病(KSD)的實(shí)驗(yàn)室診斷分析

劉 群，王 菁，劉桐山，王 鋼，韓進(jìn)剛，馮守明

(1.天津市動物疫病預(yù)防控制中心，天津 300402；2.天津市水產(chǎn)研究所，天津 300221)

錦鯉昏睡病(KSD)具有發(fā)病率高、死亡率高的特點(diǎn)，且呈現(xiàn)逐年上升態(tài)勢。本研究應(yīng)用流行病學(xué)調(diào)查、病理學(xué)觀察、分子生物學(xué)檢測等多種方法對天津地區(qū)一養(yǎng)殖場不明原因錦鯉死亡病例進(jìn)行診斷及分析，確診為由鯉浮腫病毒(Car p edema vir us，CEV)感染引起的錦鯉昏睡病(KSD)?，F(xiàn)將其實(shí)驗(yàn)室診斷與分析結(jié)果報(bào)道如下。

一、材料與方法

1.樣品取樣

疾病暴發(fā)時(shí)，深入現(xiàn)場調(diào)查養(yǎng)殖水溫、養(yǎng)殖密度、魚齡、發(fā)病率、死亡率等情況，觀察病魚活動狀態(tài)。取癥狀典型的發(fā)病魚活體置于解剖盤中，檢查其體表癥狀，解剖并剪取鰓、肝胰臟、脾、腎、腦組織，用于組織病理觀察的組織塊(不超過0.5厘米3)置于Davidson's AFA固定液固定；用于超微病理觀察的組織塊(厚度小于2毫米)置于TEM電鏡固定液中固定，并做好記錄。

2.寄生蟲檢查

觀察病魚活動情況，用顯微鏡檢查病魚有無寄生蟲。鰓絲、體表黏液采取水浸片法，腦、肝胰臟、脾、腎組織采用壓片法，血液用涂片法。制片后置于顯微鏡下觀察發(fā)病魚體表、鰓和其他內(nèi)臟組織病變情況。

3.石蠟切片制備與觀察

用于組織病理觀察的組織塊固定24小時(shí)后置于70%(體積分?jǐn)?shù))乙醇，浸泡36小時(shí)后即可制備病理切片。經(jīng)脫水、浸蠟、石蠟包埋、切片、展片、烤片、脫蠟、染色、封片等步驟后，使用ZEISS光學(xué)顯微鏡對制備好的病理切片進(jìn)行顯微觀察，并用Axio Cam數(shù)字?jǐn)z像頭結(jié)合Axio Vision圖像分析軟件進(jìn)行拍照和測量。

4.透射電鏡切片制備與觀察

用于超微病理觀察的組織塊于4℃固定24小時(shí)后，0.1摩/升磷酸緩沖液沖洗，再經(jīng)1%鋨酸固定1.5小時(shí)，置于梯度乙醇脫水，經(jīng)包埋劑包埋后制作超薄切片，透射電子顯微鏡下觀察并拍照有無疑似病毒顆粒、形態(tài)特征等超微病理變化。

5.細(xì)菌分離培養(yǎng)

使用75%(體積分?jǐn)?shù))乙醇對病魚體表消毒，無菌環(huán)境下采集病魚腦、肝胰臟、脾、腎組織，于LB瓊脂平板劃線接種，28℃培養(yǎng)24小時(shí)，觀察細(xì)菌生長情況。

6.分子生物學(xué)鑒定

(1)核酸提取。切取瀕死病魚鰓組織并研磨，于1.5毫升RNase-f r ee離心管中挑取少量研磨液，用全自動核酸提取純化移液工作站(M5073，Eppendor f)提取樣品核酸，并使用超微量核酸測定儀(IMPLEN，Ger man)測定其純度及濃度。

(2)病毒PCR檢測。參考鯉春病毒血癥病毒(SVCV)、錦鯉皰疹病毒(KHV)、鯉皰疹病毒II型(CyHV-II)、鯉浮腫病毒(CEV)相關(guān)檢測方法進(jìn)行相對應(yīng)病毒分子生物學(xué)檢測，同時(shí)以健康錦鯉基因組DNA作為陰性對照，相關(guān)檢測所用引物序列及檢測方法信息見表1。

表1 PCR檢測所用引物序列

7.人工感染試驗(yàn)

取患病錦鯉鰓組織，按1∶10(質(zhì)量體積比)加入無菌生理鹽水，研磨勻漿并反復(fù)凍融，經(jīng)差速離心收集上清液，以0.22微米濾膜過濾，采用注射終濃度2×10-2克/升組織液方式進(jìn)行人工感染試驗(yàn)。隨機(jī)取2組健康錦鯉進(jìn)行腹腔注射，每組10尾；實(shí)驗(yàn)組與對照組分別注射0.2毫升/尾組織懸液與等劑量無菌生理鹽水；(25±2)℃下水箱連續(xù)飼養(yǎng)31天，觀察發(fā)病情況，做好記錄，并及時(shí)剖檢實(shí)驗(yàn)魚和檢測病原體。

二、結(jié)果

1.現(xiàn)場調(diào)查及臨床癥狀檢查

錦鯉病例樣品取自于2018年7月末，養(yǎng)殖池塘水溫為26～29℃，起初錦鯉個別死亡，但病情進(jìn)展迅速。第1天僅死魚100余尾，第2天死魚便達(dá)500余尾，日死亡率為5%～8%。調(diào)查發(fā)現(xiàn)，發(fā)病錦鯉為9月齡，全長為(14±5)厘米，體質(zhì)量為(48±10)克，養(yǎng)殖密度約400尾/米3水體。發(fā)病魚普遍表現(xiàn)為橫臥漂浮于養(yǎng)殖池淺水區(qū)水面，聚集于池角、岸邊及進(jìn)水口等處，體表無明顯損傷；活力明顯下降，初看似已死亡，一旦有聲音刺激便游動，刺激結(jié)束后再次橫臥，發(fā)病死亡率介于50%～80%。體表臨床癥狀為頭部上方顱骨軟組織皺縮，眼球凹陷(圖1)。觀察病魚體表、體內(nèi)器官，其臨床癥狀表現(xiàn)為鰓黏臟，黏液分泌增多，有的鰓絲不完整，肝胰臟呈現(xiàn)白色，大部分發(fā)病魚脾腫大，其他組織器官無明顯異常。

圖1 發(fā)病錦鯉體表臨床癥狀

2.病理切片觀察結(jié)果

通過顯微病理觀察，患病錦鯉各組織器官出現(xiàn)不同程度病理變化，表現(xiàn)為多器官病變病理特征。其中，鰓絲末端細(xì)胞增生，呈腫大狀并黏附，有融合；鰓小片上皮細(xì)胞增生且其之間隙縫被上皮細(xì)胞填滿，可觀察到疑似包涵體存在(圖2A)。腎組織可見腎小管上皮細(xì)胞脫落水腫，部分水腫至空泡化，腎小球結(jié)構(gòu)清晰可見，組織可見少量炎癥細(xì)胞浸潤和疑似包涵體存在(圖2B)。肝細(xì)胞胞漿疏松，可見廣泛水腫，部分水腫至空泡化，并可見疑似包涵體(圖2C)。脾組織整體結(jié)構(gòu)正常，紅髓與白髓界限不清，無明顯壞死，組織可見疑似包涵體、多核巨細(xì)胞和大量黑色素巨噬細(xì)胞，未見明顯粒細(xì)胞浸潤(圖2D)。腦組織整體結(jié)構(gòu)正常，細(xì)胞排列緊密整齊，分界明顯，未見血管充血及炎癥細(xì)胞浸潤。

圖2 患病錦鯉鰓、腎、肝胰臟和脾組織病理變化

3.超微病理觀察結(jié)果

透射電鏡觀察結(jié)果顯示，病魚脾組織中可見大量晶格狀排列的病毒粒子積聚(圖3)，細(xì)胞結(jié)構(gòu)遭破壞；此次病魚樣品觀察鰓、腎、肝胰臟和腦組織中未見明顯病毒粒子，故未將圖片列出。

圖3 發(fā)病錦鯉樣品脾組織中的病毒粒子(箭頭)

4.寄生蟲檢測和細(xì)菌分離結(jié)果

經(jīng)制片和顯微觀察，所檢錦鯉病魚組織均未觀察到寄生蟲。將病魚腦、肝胰臟、脾、腎組織病料接種于LB平板上，28℃培養(yǎng)24小時(shí)，未見細(xì)菌生長。

5.分子生物學(xué)檢測結(jié)果

采用相關(guān)檢測方法對2018年7月末采集的患病錦鯉鰓組織樣品進(jìn)行SVCV、KHV、CyHV-II、CEV分子生物學(xué)檢測，結(jié)果顯示，發(fā)病錦鯉鰓組織樣品均未擴(kuò)增出SVCV、KHV、CyHV-II特異性片段(未列出)；CEV TaqMan熒光定量檢測方法結(jié)果如圖4A，顯示該樣品Ct值小于35，CEV為陽性。

6.人工感染試驗(yàn)結(jié)果

養(yǎng)殖水溫為(25±2)℃時(shí)，由患病錦鯉鰓組織制備組織懸液腹腔注射感染健康錦鯉，并依據(jù)《鯉浮腫病診斷規(guī)程》(SC/T 7229－2019)中的檢測方法對注射組、對照組錦鯉鰓組織進(jìn)行CEV TaqMan熒光定量PCR檢測，結(jié)果如圖4B所示。人工感染試驗(yàn)結(jié)果顯示，注射組死亡錦鯉未呈現(xiàn)CEV典型癥狀，統(tǒng)計(jì)錦鯉累積死亡率，其累積死亡率為(65±7.07)%，半數(shù)致死時(shí)間(LT50)為16天；對照組累積死亡率為(15±7.07)%(圖5)。CEV Taq-Man熒光定量PCR檢測結(jié)果顯示，注射組20尾錦鯉中有14尾為CEV陽性，其陽性檢出率為70%，對照組未檢出CEV。

圖4 錦鯉鰓組織樣品CEV TaqMan熒光定量PCR擴(kuò)增曲線

圖5 人工感染試驗(yàn)中累積死亡率與注射時(shí)間關(guān)系

三、討論

本研究根據(jù)天津市北辰區(qū)某錦鯉養(yǎng)殖場患病錦鯉流行病學(xué)調(diào)查及病理學(xué)、寄生蟲學(xué)、細(xì)菌學(xué)、病毒學(xué)鑒定結(jié)果，確定2018年夏季引起該養(yǎng)殖場錦鯉暴發(fā)性死亡的原因?yàn)殄\鯉睡眠病(KSD)，其病原為鯉浮腫病毒(CEV)。

從臨床癥狀上看，病魚常聚集于水面或池塘邊緣，或靜置于池中倒向一側(cè)，呈昏睡狀態(tài)。受觸動時(shí)會游動，但很快處于昏睡狀態(tài)。大多表現(xiàn)出爛鰓、體表糜爛、出血、皮下組織水腫、眼球凹陷、食欲不振、吻端和鰭基部潰瘍等臨床特征(Adamek M等，2017；呂曉楠等，2018)。本研究中感染KSD錦鯉表現(xiàn)出與之相似的臨床表觀特征，不同的是筆者所解剖錦鯉未觀察到體表糜爛、出血、皮下組織水腫、吻端和鰭基部潰瘍病變特征。針對人工感染試驗(yàn)后出現(xiàn)的臨床癥狀也有不同報(bào)道，Oyamatsu T等(1997b)、Miyazaki T等(2005)和劉群等(2018)通過人工感染方式回接健康鯉，導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)魚部分出現(xiàn)與自然發(fā)病魚相似癥狀而死亡；Adamek M等(2016)、Matras M等(2016)和王小亮等(2017)研究發(fā)現(xiàn)部分實(shí)驗(yàn)魚感染CEV，但未呈現(xiàn)典型癥狀和大量死亡現(xiàn)象。本研究人工感染試驗(yàn)可致70%錦鯉感染CEV，且(65±7.07)%出現(xiàn)死亡，但未表現(xiàn)出典型臨床癥狀。由此推測，鯉感染CEV出現(xiàn)KSD典型臨床癥狀和大量死亡可能由其他因素引起，仍需深入研究。

從組織病理結(jié)果上看，包括爛鰓在內(nèi)的鰓絲損傷是受感染錦鯉最常見的癥狀。低倍鏡觀察到鰓組織上皮細(xì)胞過度增殖導(dǎo)致鰓絲腫脹；高倍鏡下顯示鰓細(xì)胞水腫、重度增生，鰓小片有融合及上皮細(xì)胞脫落(Lewisch E等，2015；Adamek M，2017；Ono S I，1986)。本研究顯示患病錦鯉鰓組織為主要病變組織，其病理特征與Lewisch E等(2015)、Ono S I(1986)、Oyamatsu T等(1997b)的研究結(jié)果相似。此外，患KSD的錦鯉肝胰臟、腎臟和脾臟也都發(fā)生不同程度病變，出現(xiàn)細(xì)胞廣泛水腫，可見疑似包涵體、炎癥細(xì)胞浸潤等較嚴(yán)重病理變化，而其腦組織整體結(jié)構(gòu)正常，未見明顯病理變化。Oyamatsu T等(1997b)認(rèn)為CEV感染鯉引起的鰓損傷導(dǎo)致患病魚鰓組織和內(nèi)臟組織呈現(xiàn)病理變化。由此推測，引起KSD的致病原侵染魚體后在最易受寄生蟲或水質(zhì)影響而被破壞的鰓組織內(nèi)增殖，使鰓絲末端細(xì)胞增生，并隨血液進(jìn)入體內(nèi)組織，從可能影響血液氣體交換發(fā)展到體內(nèi)組織發(fā)生變質(zhì)性炎癥，導(dǎo)致魚出現(xiàn)缺氧、浮頭、反應(yīng)遲緩，致使魚體呼吸及滲透壓調(diào)節(jié)發(fā)生障礙，肝胰臟、腎、脾等重要器官正常的生理代謝功能受到損害，終至死亡。

國外現(xiàn)有研究表明痘病毒科種類傳播主要方式是經(jīng)皮膚傷口感染，并在鰓組織中觀察到病毒粒子，認(rèn)為鰓是CEV在魚體內(nèi)引起典型病變的主要部 位(Jung S V，2015；Rajaswaminathan T，2016；Ono S I，1986)。國內(nèi)現(xiàn)有研究已在腎組織中觀察到形態(tài)類似痘病毒顆粒(徐立蒲等，2017)，表明其可在腎組織中增殖富集。本次實(shí)驗(yàn)室診斷在發(fā)病魚脾組織中觀測到大量病毒樣顆粒，表明除鰓、腎組織外，CEV也可在脾組織增殖，提示做病原檢測等研究時(shí)，可取鰓、腎、脾組織；而電鏡觀測病毒方法雖直觀有效，但其制備過程較復(fù)雜，周期較長，多用于科研，不適用于臨床檢測工作。

通常認(rèn)為水溫是發(fā)生CED、KSD的環(huán)境誘因。Miyazaki T等(2005)認(rèn)為水溫是影響CEV的重要環(huán)境因子。研究發(fā)現(xiàn)，較低水溫(6～10℃)時(shí)，錦鯉感染CEV病程較長，死亡率較低；15～25℃時(shí)，幼魚累積死亡率高達(dá)75%～100%；較高溫度時(shí)，實(shí)驗(yàn)魚最初僅昏睡，2～3天大量死亡。有調(diào)查研究發(fā)現(xiàn)，該病在我國河南等地有兩個發(fā)病高峰時(shí)間，即5－6月和9月(呂曉楠等，2018)。這兩個時(shí)間段的水溫一般維持在20～27℃。本研究進(jìn)行的人工感染試驗(yàn)可導(dǎo)致錦鯉累積死亡率達(dá)到(65±7.07)%，表明在(25±2)℃下CEV可致錦鯉出現(xiàn)大量死亡。據(jù)此推測CEV在我國傳播最適水溫可能是20～27℃。同時(shí)，綜合現(xiàn)有資料，CEV可在較寬溫度范圍內(nèi)(6～27℃)被檢出，提示該病暴發(fā)可能是包括溫度在內(nèi)的其他因素共同作用的結(jié)果。

針對KSD防控方面，Miyazaki T等(2005)、Seno R等(2003)研究指出，將發(fā)病魚從飼養(yǎng)池取出，當(dāng)水溫升到20～25℃時(shí)，使用6‰～7‰鹽水加抗生素持續(xù)進(jìn)行藥浴10～14天，對防控此病有顯著效果。另外，進(jìn)入越冬池時(shí)，可以使用6‰～7‰鹽水浴并升溫，之后逐漸添加少量新水以沖淡鹽水，可預(yù)防此病。但是體形較小幼魚較難恢復(fù)，通常多在采卵時(shí)采取凈化措施預(yù)防。使用此種方式能夠抑制病原體黏附宿主，提高魚體免疫力，幫助維持魚體滲透壓，有助于降低該疫病發(fā)生時(shí)魚體死亡率，但是治愈后的魚仍可能具有傳染性，并不能從根本上殺死或消滅病毒。

本研究綜合應(yīng)用流行病學(xué)調(diào)查、病理學(xué)、寄生蟲學(xué)、細(xì)菌學(xué)方法，并依據(jù)針對病毒P4a基因設(shè)計(jì)的熒光定量PCR檢測方法將導(dǎo)致此次錦鯉暴發(fā)性死亡的致病原鑒定為CEV。值得注意的是，該養(yǎng)殖場此前未曾暴發(fā)過KSD。推測該養(yǎng)殖場可能存在其他途徑的病原傳入風(fēng)險(xiǎn)，仍有待進(jìn)一步調(diào)查以證實(shí)。因此，在生產(chǎn)中要嚴(yán)格執(zhí)行消毒和隔離制度，通過檢測、檢疫防止病原侵入，采取生物安保措施防范KSD的發(fā)生和蔓延。