黃顙魚“裂頭病”細(xì)菌性病原的分離與鑒定

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黃顙魚（Pelteobagrus fulvidraco Richardson）是我國主要淡水水域中分布比較廣、具有比較高經(jīng)濟(jì)價(jià)值的小型魚類，因其肉質(zhì)細(xì)嫩、味道鮮美、肌間刺少，深受廣大消費(fèi)者的歡迎。近年來，在江蘇、浙江、廣東和四川省的部分地區(qū)，人工養(yǎng)殖黃顙魚規(guī)模和集約化程度不斷增加，部分養(yǎng)殖戶也因養(yǎng)黃顙魚成功而獲得了比較好的經(jīng)濟(jì)效益。伴隨黃顙魚養(yǎng)殖規(guī)模的迅速擴(kuò)大、集約化程度大幅度提高，各種疾病對(duì)黃顙魚的危害也日趨嚴(yán)重，其中細(xì)菌性疾病就是對(duì)養(yǎng)殖黃顙魚危害比較嚴(yán)重的一類疾病。國內(nèi)報(bào)道的黃顙魚細(xì)菌性疾病的病原主要有屬于氣單胞菌屬（Aeromonas）的部分種類，如氣單胞菌點(diǎn)狀亞種（Aeromonas subsppunctata）等，可以引起黃顙魚發(fā)生爛鰓、腸炎、打印病、出血性水腫等癥狀。

自2012年5月開始，我們對(duì)江蘇省鹽城和浙江省菱湖地區(qū)人工飼養(yǎng)過程中出現(xiàn)“裂頭病”的黃顙魚進(jìn)行了致病菌的初步研究。從患病池塘中收集具有典型病癥黃顙魚，從腹水、肝臟、腎臟等處分離細(xì)菌，結(jié)果獲得了在培養(yǎng)基上形態(tài)高度一致的菌落，用其人工感染健康黃顙魚的結(jié)果證實(shí)了所分離的菌株即為引起黃顙魚“裂頭病”的病原菌。經(jīng)過采用經(jīng)典的生理生化指標(biāo)測(cè)定及16SrDNA同源性及系統(tǒng)發(fā)育分析等結(jié)果，確定了引起黃顙魚“裂頭病”致病菌為鮰愛德華菌（Edwardsiella ictaluri）?，F(xiàn)將研究結(jié)果報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

具有“裂頭病”典型癥狀的患病黃顙魚（圖1），于2008年5~10月采自江蘇省鹽城地區(qū)和浙江省菱湖地區(qū)的部分養(yǎng)殖場(chǎng)飼養(yǎng)黃顙魚的池塘。這些患病黃顙魚體長在3.0~13.0 cm之間；健康黃顙魚取自江蘇鹽城大浩水產(chǎn)（鹽城）有限公司大豐養(yǎng)殖場(chǎng)的黃顙魚養(yǎng)殖池塘，體長約為（5.5±1.6）cm。

1.2 病原菌分離

取具有典型“裂頭病”病癥的黃顙魚，用70.0%酒精進(jìn)行體表消毒后，在無菌條件下按照無菌操作的方法，分別從其肝臟、腎臟、鰓、潰爛皮膚處及腹水等病灶處采樣，劃線接種于BHI（Difco）瓊脂平板上，在36℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h后，挑取形態(tài)特征大致相同的優(yōu)勢(shì)菌落進(jìn)行分離、純化3次，轉(zhuǎn)接于試管斜面培養(yǎng)基中，低溫條件下保存。

1.3 人工攻毒

選擇健康、活潑無外傷，平均體長為（6.3±0.6）㎝的黃顙魚作試驗(yàn)魚。在每個(gè)1.0m×1.0 m×0.5 m的塑料水族箱中飼養(yǎng)30尾黃顙魚，每天投喂相當(dāng)于魚體重2.0％的人工配合飼料（鹽城裕達(dá)飼料有限公司生產(chǎn)的黃顙魚專用配合飼料）。馴養(yǎng)10d，待供試黃顙魚適應(yīng)環(huán)境，并確認(rèn)無疾病癥狀后，開始試驗(yàn)。試驗(yàn)期間日均換飼養(yǎng)水量約50.0％，連續(xù)充氧并且及時(shí)清污。設(shè)置4組試驗(yàn)組及2個(gè)對(duì)照組，每組30尾黃顙魚。利用從患病黃顙魚體內(nèi)分離并經(jīng)過純化培養(yǎng)的5個(gè)菌株，在BHI培養(yǎng)基中培養(yǎng)72 h后，用滅菌生理鹽水洗下菌落、稀釋成濃度為3.2×l07cfu/mL，作為攻毒菌液備用。

采用2種方法進(jìn)行活菌攻毒，一種是注射法攻毒法。即直接對(duì)每尾黃顙魚的胸鰭基部注射菌濃度為3.2×l07cfu/mL的活菌液0.1mL后，放入水族箱中繼續(xù)飼養(yǎng)觀察（圖4）。每個(gè)菌株制備的菌液采用2個(gè)平行組作為注射法試驗(yàn)組，對(duì)另一組黃顙魚注射相同劑量的滅菌生理鹽水，作為注射法的對(duì)照組。

另一種是浸浴法攻毒，即首先向玻璃燒杯中添加適量的活菌液，使水中的菌濃度達(dá)到3.2×l05cfu/mL，再將以鋼絲球劃傷體表的黃顙魚放置于玻璃燒杯中浸泡1.0h以上，以保證供試魚體能充分接觸到病原菌（圖5）。浸泡后的黃顙魚放回塑料水族箱中繼續(xù)飼養(yǎng)、觀察。

經(jīng)過不同方法活菌攻毒后的黃顙魚在飼養(yǎng)觀察15d的過程中，記錄其發(fā)病癥狀和死亡數(shù)量，取呈現(xiàn)與自然條件下相同的典型“裂頭病”癥狀的黃顙魚，從腹水、鰓、肝、潰爛皮膚處進(jìn)行病原菌的再分離、鑒定。

1.4 生理生化指標(biāo)測(cè)定

病原菌生理生化特征的測(cè)定及有關(guān)分類鑒定參考《一般細(xì)菌常用鑒定方法》（中國科學(xué)院北京微生物研究所細(xì)菌分類組，1978）和《伯杰細(xì)菌鑒定手冊(cè)（第九版）》（布坎南和吉本斯，1994）。

1.5 16SrDNA序列同源性分析及系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建

1.5.1 模板DNA的制備

挑取單菌落懸浮于50.0μL的去離子水中，100.0℃水浴加熱5.0 min；4℃條件下，以12,000 r/min 的速度離心20 min，上清即作為模板DNA。

1.5.2 PCR擴(kuò)增

利用細(xì)菌16SrDNA廣譜引物，正向27F：5’ -AGAGTTTGATC（C/A）TGGCTCAG- 3’（對(duì)應(yīng)于Escherichia coli 16SrDNA的8-27 bp位置），反向1492R：5’ -TACGG（C/T）TACCTT GTTACGACTT- 3’（對(duì)應(yīng)于E．coli 16S rDNA的第1492-1510 bp位置）進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系（100μL）含10.0 μL 10.0×PCR緩沖液（含Mg2 ），2.0μL l0.0 mmo/L 4×dNTP，各5.0μL10.0μmol/L正向和反向引物，1.0μL Taq DNA聚合酶（5U），10.0μL模板。PCR反應(yīng)條件為：94℃變性4min；94℃ 平衡30s，55℃退火30s，72℃延伸1min 40s，30個(gè)循環(huán)；72℃ 溫育6min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物由上海生工生物工程技術(shù)有限公司進(jìn)行純化和測(cè)序。

1.5.3 序列分析

將測(cè)得的菌株16SrDNA序列輸入到GenBank數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行Blast比對(duì)，并與從GenBank數(shù)據(jù)庫中獲得的相近序列一起，運(yùn)用Clustalx1.8軟件進(jìn)行多重序列匹配排列，生成MEGA格式文件。使用MEGA 3.0軟件，采用鄰接法（Neighbour-joining）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。通過自展分析（Bootstrapping）進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育樹的置信度評(píng)估，自展數(shù)據(jù)集為1,000次。

1.5.4 核酸序列

用于構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹的相關(guān)菌株及其在GenBank核苷酸序列數(shù)據(jù)庫中的序列存取號(hào)如表1所示。

2 結(jié)果

2.1 人工活菌攻毒后黃顙魚的癥狀與死亡狀態(tài)

黃顙魚經(jīng)過不同的方式人工感染分離的菌株以后，死亡的數(shù)量以及開始死亡的時(shí)間均有所不同，詳細(xì)結(jié)果見表2。

由表2所示，從受感染的黃顙魚死亡數(shù)量以及開始死亡的時(shí)間可以看出，分離菌株的毒力強(qiáng)弱是有所不同的。經(jīng)過注射攻毒的黃顙魚最早的死亡發(fā)生于注射菌株后的第48h，浸浴攻毒的死亡率相對(duì)比較低，而注射攻毒組死亡率比較高，試驗(yàn)組死亡率最高達(dá)到100.0%。試驗(yàn)魚在臨死之前呈現(xiàn)的癥狀與自然條件下的患病魚相似，主要呈現(xiàn)出體表、頭部充血。而對(duì)照組黃顙魚活動(dòng)正常，未出現(xiàn)死亡現(xiàn)象。從病魚的鰓、肝臟、腎臟、腹水及潰爛皮膚等處再次分離到了感染菌，試驗(yàn)結(jié)果符合柯赫法則。

在試驗(yàn)條件下，出現(xiàn)疾病癥狀的病魚攝食減少，游動(dòng)遲緩，常獨(dú)自游弋在水面或垂直懸浮于水面，有不停旋轉(zhuǎn)的癥狀；體表（包括鰭、鰭基、頭部、鰓蓋、口部、下頜、腹面及其它體表部位）出現(xiàn)不同程度出血現(xiàn)象；腹部腫脹，積有腹水；肝臟充血或出血、或因失血呈色淡，后期伴有背部、頭部出血、皮膚潰爛，死亡率也是非常高的。

2.2 致病菌的生理生化特性鑒定

從具有典型病癥的黃顙魚的腹水、肝臟、腎臟、鰓、潰爛皮膚等處均分離到占優(yōu)勢(shì)的菌株，菌落形態(tài)、大小、顏色在BHI瓊脂平板上均一致：菌落圓形、邊緣整齊、灰白色、濕潤。對(duì)其中該5個(gè)菌株進(jìn)行進(jìn)行的生理生化特性分析結(jié)果如表3。

由表3所示結(jié)果可以看出革蘭氏染色、鞭毛染色等光鏡觀察、生理生化指標(biāo)測(cè)定結(jié)果顯示，氧化酶陰性、精氨酸雙水解酶陰性、尿素酶陰性、H2S產(chǎn)生陽性、吲哚產(chǎn)生陽性、乳糖水解陰性、蔗糖水解陰性、鼠李糖水解陰性、接觸酶陽性、賴氨酸脫羧酶陰性、枸椽酸鹽陰性、明膠水解陰性、鳥氨酸脫羧酶陽性、過氧化氫酶陰性、V.P實(shí)驗(yàn)陰性、甲基紅試驗(yàn)陽性、丙二酸利用陰性、七葉苷水解陰性、L-阿拉伯糖水解陰性、D-甘露糖利用陽性、山梨醇水解陰性、麥芽糖水解陽性和葡萄糖發(fā)酵產(chǎn)酸、產(chǎn)氣；進(jìn)行16S rDNA序列分析后發(fā)現(xiàn)它們各項(xiàng)指標(biāo)均一致，故取其中1株HSY-12-02（從腎臟中分離純化獲得）為代表菌株，進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.3 16S rDNA序列系統(tǒng)發(fā)育分析

從患病黃顙魚腎臟中分離獲得HSY-12-02菌株與作為對(duì)照的鮰愛德華菌（中國微生物菌種中心）PCR結(jié)果（圖6）。GenBank中同源序列檢索結(jié)果顯示，HSY-12-02與鮰愛德華菌屬細(xì)菌的l6S rDNA序列自然聚類，與實(shí)驗(yàn)菌相似度最高的10多個(gè)結(jié)果同屬Edwardsiella屬，其中與鮰愛德華菌的同源性最高，達(dá)99.0％。在檢索結(jié)果中選取9個(gè)參比菌株，從Genbank中下載其l6S rDNA序列，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹；系統(tǒng)發(fā)育樹中同一個(gè)種的2個(gè)標(biāo)準(zhǔn)菌株親緣關(guān)系最近并聚為1個(gè)分支，在中實(shí)驗(yàn)菌株與鮰愛德華菌自然聚為一支，表明它們親緣關(guān)系最近，因此，我們將其初步鑒定為鮰愛德華菌（Edwardsiella ictaluri）。

3 討論

對(duì)引起魚類疾病的致病菌分離后鑒定的方法主要有3種，即傳統(tǒng)的生理生化指標(biāo)測(cè)定法，由自動(dòng)鑒定系統(tǒng)鑒定的方法和運(yùn)用分子生物學(xué)手段進(jìn)行鑒定的方法（郭明元等，2006）。這些方法各有其特點(diǎn)和不足，傳統(tǒng)的生理生化實(shí)驗(yàn)因?yàn)椴僮鬟^程比較繁瑣、耗時(shí)長且受主觀因素影響比較大；16SrDNA系統(tǒng)發(fā)育樹分析通過比較細(xì)菌核糖體RNA基因片段的同源性實(shí)現(xiàn)對(duì)細(xì)菌的分類學(xué)鑒定，可靠性比較強(qiáng)，但是，到目前為止尚有多種細(xì)菌的完整16SrDNA序列尚未被測(cè)定，因此，給新鑒定細(xì)菌的結(jié)果準(zhǔn)確性也可能帶來一定的影響，最好還需要有生化特性鑒定結(jié)果作為其佐證（范文輝等，2005）。本研究中在采用生理生化指標(biāo)測(cè)定其菌株特性的基礎(chǔ)上，還運(yùn)用分子生物學(xué)手段進(jìn)行了鑒定，兩種方法互相驗(yàn)證，所獲得的結(jié)果應(yīng)該是比較準(zhǔn)確的。

根據(jù)已經(jīng)有的研究結(jié)果，鮰愛德華菌具有比較特殊的寄生狀態(tài)，即當(dāng)進(jìn)入魚體的鮰愛德華菌被吞噬細(xì)胞吞噬后，不會(huì)被細(xì)胞殺死，而是可以隨吞噬細(xì)胞而被帶入肝臟和腎臟的類血竇，還可以在吞噬細(xì)胞內(nèi)增殖，從而破壞這些吞噬細(xì)胞。擴(kuò)散出來的鮰愛德華菌又可感染類血竇周圍的內(nèi)皮細(xì)胞，并且在此形成一個(gè)微小的病灶，隨后逐漸擴(kuò)大（Wakabayashi and Egusa，1972；Wakabayashi and Egusa，1973）。鮰愛德華菌對(duì)魚類的感染范圍也是很廣的，與其它發(fā)生愛德華菌病的魚類相比，黃顙魚發(fā)生鮰愛德華菌病以后，最為典型的特有癥狀是頭部發(fā)紅（這個(gè)癥狀與患病的斑點(diǎn)叉尾鮰有相似之處），腹部膨大并積有大量血紅色腹水，同時(shí)體表出現(xiàn)出血點(diǎn)或者血斑。

此外，愛德華菌可以感染蛇、蜥蜴、龜、鱷等變溫動(dòng)物及鳥類、臭鼬、豬、馬、家兔等恒溫動(dòng)物，有人認(rèn)為愛德華菌是蛇類正常腸道菌群的成員之一（Sakazaki，1965）。

（作者：陳福昌、宋剛杰、孫立威、吳強(qiáng)強(qiáng)、何登平、張加林 華中農(nóng)業(yè)大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院、蘇州通威特種飼料有限公司）

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