草魚(yú)細(xì)菌性敗血癥致病菌的分離和鑒定研究報(bào)告

摘要

2018~2021年，從遼寧省沈陽(yáng)市遼中區(qū)水產(chǎn)養(yǎng)殖區(qū)患細(xì)菌性敗血癥（bacterial septicemia）的草魚(yú)（Ctenopharyngodon idella）體內(nèi)，共分離獲得64個(gè)菌株。

經(jīng)鑒定其中有54個(gè)菌株屬于嗜水氣單胞菌（Aaeromonas hydrophila）。采用注射感染的方式，分別檢測(cè)了A.hydrophila的54個(gè)分離菌株對(duì)健康草魚(yú)的致病力。試驗(yàn)結(jié)果證明，分離菌株對(duì)健康草魚(yú)均具有一定的致病力。但是，不同分離菌株對(duì)健康草魚(yú)的致病力大小存在明顯差異。

對(duì)于養(yǎng)殖草魚(yú)（Ctenopharyngodon idella）的細(xì)菌性敗血癥（bacterial septicemia），抗生素類(lèi)“國(guó)標(biāo)漁藥”的治療效果越來(lái)越差[1,2]。在我國(guó)不同的水產(chǎn)養(yǎng)殖區(qū)均屬于能引起嚴(yán)重經(jīng)濟(jì)損失的魚(yú)類(lèi)病害。為了研制免疫防控這種疾病的“自家疫苗”[3]，我們于2018~2021年的養(yǎng)殖期內(nèi)，從患病草魚(yú)體內(nèi)分離、收集到了一些致病菌株，完成了分離菌株的種屬鑒定與致病力研究?，F(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下。

01材料與方法

1.1致病菌的分離

2018年6至2021年6月，在位于遼寧省沈陽(yáng)市遼中區(qū)的多個(gè)水產(chǎn)養(yǎng)殖場(chǎng)，從患細(xì)菌性敗血癥的草魚(yú)的肝、脾和腎臟中，用BHIA（Diffco）培養(yǎng)基分離致病菌株，將分離接種后的培養(yǎng)皿置于25℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，取單個(gè)菌落進(jìn)行純分離后，取分離純化后的致病菌菌株，接種在試管內(nèi)斜面培養(yǎng)基上。備作鑒定其種屬的分離菌株。

1.2分離致病菌株的種屬鑒定

將從患病草魚(yú)體內(nèi)分離獲得的64個(gè)分離菌株，送到華中農(nóng)業(yè)大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院徐鎮(zhèn)教授的實(shí)驗(yàn)室，采用檢測(cè)分離菌株生理生化特性并結(jié)合16S rRNA基因分子鑒定的方法[4,5]，對(duì)分離菌株完成了所屬種屬的鑒定。

1.3 嗜水氣單胞菌活菌液的制備

對(duì)于鑒定為嗜水氣單胞菌（Aaeromonas hydrophila）的54個(gè)分離菌株，接種在BHIA培養(yǎng)基中，置于25℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后，用滅菌生理鹽水洗下菌苔，并且以離心法集菌。再以滅菌生理鹽水將菌液濃度調(diào)節(jié)為106cfu/mL，置于4℃冰箱中保存，作為接種健康草魚(yú)的A.hydrophila活菌液，冷藏備用。

1.4供試魚(yú)與分離菌株的毒力測(cè)定

將每尾魚(yú)體重為25.0~30.0g、外觀(guān)無(wú)傷的草魚(yú)魚(yú)種，在每個(gè)盛有1.0M3去氯自來(lái)水的圓形玻璃鋼水族箱中，放養(yǎng)30尾供試草魚(yú)。按照供試魚(yú)總體重，每天投喂1.5%的人工配合飼料，連續(xù)飼養(yǎng)7d后，檢查供試草魚(yú)體表有無(wú)受傷，活動(dòng)是否正常。將身體無(wú)傷、游動(dòng)正常的草魚(yú)留下作為供試草魚(yú)。在試驗(yàn)期間，水族箱中水體的溫度保持在22~25℃之間。

將上述濃度為106cfu/mL的A.hydrophila活菌液，對(duì)每尾供試草魚(yú)的胸鰭基部注射0.25mL，作為活菌攻毒的試驗(yàn)組。每個(gè)分離菌株的活菌液注射10尾供試草魚(yú)，以剪去供試草魚(yú)少量左、右胸鰭鰭條，作為注射不同分離菌株的標(biāo)識(shí)后，每個(gè)水族箱共放養(yǎng)30尾供試草魚(yú)。以注射相同劑量滅菌生理鹽水的草魚(yú)，作為未注射分離菌株菌液的對(duì)照組。

將注射接種A.hydrophila活菌液后的供試草魚(yú)，放回水族箱繼續(xù)充氣飼養(yǎng)觀(guān)察14d，記錄供試草魚(yú)出現(xiàn)病癥與死亡發(fā)生的時(shí)間，對(duì)死亡魚(yú)體進(jìn)行致病菌再分離和解剖檢查，判定是否死于人工接種致病菌的感染。根據(jù)供試草魚(yú)的死亡數(shù)量，評(píng)價(jià)分離A.hydrophila菌株對(duì)健康草魚(yú)的致病力。

02結(jié)果

利用從2018~2021年間，由遼寧省沈陽(yáng)市遼中區(qū)水產(chǎn)養(yǎng)殖場(chǎng)出現(xiàn)的患病草魚(yú)體內(nèi)，分離獲得的A.hydrophila共54個(gè)菌株，對(duì)供試健康草魚(yú)注射0.25mL菌液濃度為106cfu/mL的A.hydrophila活菌液后，觀(guān)察到供試草魚(yú)在14d內(nèi)的死亡情況見(jiàn)表1所示。由表1所示數(shù)據(jù)。

表1供試草魚(yú)在注射嗜水氣單胞菌（A.hydrophila）

活菌液后的死亡時(shí)間與數(shù)量

可以看出所有A.hydrophila活菌液，均對(duì)健康草魚(yú)具有不同程度的致病力。但是，不同的分離菌株毒力強(qiáng)弱存在顯著差別。有部分分離菌株在接種健康草魚(yú)后的7d內(nèi)，均可導(dǎo)致全部供試草魚(yú)死亡。經(jīng)過(guò)對(duì)死亡魚(yú)體再分離致病菌時(shí)，也證明是由于人工注射A.hydrophila活菌液致病死亡。

03討論

2018年6月至2021年7月，從遼寧省沈陽(yáng)市遼中區(qū)水產(chǎn)養(yǎng)殖區(qū)患細(xì)菌性敗血癥的草魚(yú)肝、脾和腎臟中，共分離到64個(gè)分離菌株。經(jīng)生物化學(xué)特性和分子生物學(xué)方法鑒定其致病病原主要為氣單胞菌的一些種類(lèi)，其中有54個(gè)菌株被鑒定為A.hydrophila。

根據(jù)過(guò)去已有的研究結(jié)果，不同菌株的A.hydrophila體內(nèi)存在毒力因子的狀況是有差異的。在本研究中采用的注射活菌液的感染的方式，獲得了與前人相似的研究結(jié)果，即對(duì)健康草魚(yú)注射接種相同劑量的A.hydrophila活菌液后，供試健康草魚(yú)的死亡率為30.0%至100.0%之間。

為了研制用于預(yù)防遼寧省沈陽(yáng)市遼中水產(chǎn)養(yǎng)殖區(qū)養(yǎng)殖草魚(yú)細(xì)菌性敗血癥的“自家疫苗”，我們還將對(duì)這些具有較強(qiáng)毒力A.hydrophila菌株的血清型狀況，做進(jìn)一步的研究。

參考文獻(xiàn)

[1]陳昌福，馮東岳，陳輝，張朝暉，方蘋(píng). 對(duì)減少漁藥用量行之有效的幾條措施[J]. 當(dāng)代水產(chǎn)，2017，12，78~79.

[2] 陳昌福. 試談水產(chǎn)養(yǎng)殖動(dòng)植物病害防控中的問(wèn)題與對(duì)策[J]. 中國(guó)水產(chǎn)，2014（3）：71~73.

[3]陳昌福，李清，陳輝. 試談研制水生動(dòng)物用“自家疫苗”的必要性與管理規(guī)范. 當(dāng)代水產(chǎn)，2018，5，76~78.

[4]布坎南．伯杰．細(xì)菌鑒定手冊(cè)[M]．第8版，北京：科學(xué)出版社，1984，482~485．

[5] 東秀珠，蔡妙英．常見(jiàn)細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)[M]．北京：科學(xué)出版社，2001，162~171．